Анализ обезьяньего вируса иммунодефицита специфических CD8 ⁺ Т-клетки в макак-резусов пептидными-MHC-I тетрамере Окрашивание

Общая цель этого анализа состоит в том, чтобы перечислить и охарактеризовать популяции CD8-положительных Т-клеток, специфичных для вируса иммунодефицита обезьян, полученных в результате вакцинации или первичной инфекции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области Т-клеточной иммунологии, например, какова частота антиген-специфических CD8 Т-клеток, индуцированных вакцинацией или инфекцией. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет количественно определять антиген-специфичные CD8 Т-клетки в биологических образцах, полученных непосредственно ex vivo, без необходимости повторной стимуляции in vitro.

Применение этого метода распространяется на оценку специфичных для разреза CD8 Т-клеток у макак-резуса, а также на изучение Т-клеточных ответов CDB при различных заболеваниях. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за неполных знаний о генетике макак-резус-макак, а также из-за того, что проточное цитометрическое окрашивание требует точного применения антител. Начните с повторного суспендирования резус-фактора PBMC в среде R10.

Добавьте 1,6 умножить на 10 к седьмой клетке на миллилитр концентрации. Аквотируйте 50 микролитров клеток на соответствующее количество пробирок проточной цитометрии, и добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров ингибитора протеинкиназы. Сделайте вихревую насадку в каждой пробирке и инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Правильное количество титруемого пептида тетрамера MHC должно быть разбавлено в мастер-смеси, достаточной для окрашивания всех экспериментальных пробирок. Поэтому важно подготовить 15%-ный избыток мастер-смеси, чтобы учесть ошибки пипетирования. Во время инкубации клеток гранулируйте белковые агрегаты в растворе тетрамера центрифугированием, чтобы свести к минимуму фоновое окрашивание.

Затем разведите тетрамеры в достаточном буфере для окрашивания, так что в каждую пробирку проточной цитометрии можно добавить 25 микролитров мастер-смеси тетрамера. Затем проведите вихревую обработку пробирок с образцами и инкубируйте растворы тетрамера PBMC в темноте, при комнатной температуре в течение 45 минут. По окончании инкубации добавьте 50 микролитров красящей мастер-смеси в соответствующие пробирки с образцами.

И перемешайте трубочки для вортексинга. Через 25 минут в темноте при комнатной температуре промойте клетки промывочным буфером, гранулируйте клетки центрифугированием и осторожно сцедите надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Переведите клетки в оставшийся буфер в каждой пробирке и зафиксируйте образцы 250 микролитрами 2% параформальдегида на пробирку.

Сразу же сделайте вихрь и инкубируйте трубки в темноте, при температуре 4 градуса Цельсия. Через 20 минут промойте клетки в свежем буфере для промывки. Гранулируйте клетки центрифугированием и сцеживайте надосадочную жидкость, не повреждая гранулу.

Повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах пермеабилизационного буфера, вихря и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Затем вымойте и гранулируйте клетки. Затем сцедите надосадочную жидкость, как описано ранее.

Приступайте к добавлению 50 микролитров внутриклеточной красительной мастер-смеси в соответствующие пробирки. Ввергните каждый образец в вихрь и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. После того, как инкубация будет завершена, промойте и гранулируйте клетки.

Теперь образцы готовы к получению с помощью проточного цитометра. Тетрамеры Mamu-B017.01 обычно дают тусклое окрашивание, которое может быть существенно улучшено путем предварительной обработки клеток ингибитором протеинкиназы. Чтобы избежать фонового окрашивания, совместимые клетки MHC класса один, которые содержат или не содержат антиген-специфичную популяцию CD8-положительных Т-клеток, представляют интерес, должны быть помечены соответствующим тетрамером и множественными разведениями, чтобы определить оптимальное количество, которое приводит к наилучшему разделению между тетрамеров-положительными и отрицательными CD8-положительными Т-клетками.

На этих графиках показана стратегия гейтирования, используемая для анализа величины и фенотипа памяти индуцированных вакциной реакций Gag CM9 CD8-положительных Т-клеток у макак-резус-резуса Mamu-A 01. Следует отметить, что тетрамеров-положительная популяция CD8-положительных Т-клеток хорошо отделена друг от друга с минимальным фоновым окрашиванием. И с подмножествами памяти, четко очерченными их экспрессией CD28, CCR7 и Granzyme B в пределах тетрамеров.

После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за три часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о добавлении правильных реагентов в каждую мастер-смесь антител или тетрамеров и работать с экспериментальными пробирками каждый раз, как показано на рисунке. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению специфичности и фенотипа антиген-специфических CD8 Т-клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить окрашивание тетрамером MHC первого класса в анализе модели макак-резуса исследования ВИЧ-1 СПИДа у человека. Не забывайте, что работа с биологическими образцами макак-резусов требует особых мер предосторожности, таких как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты во время обработки образцов.