Colon-26 РАК-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ мышь в качестве модели для изучения рака кахексия

Общие цели этого протокола заключаются в том, чтобы выполнить модель Colon 26 in vivo в воспроизводимом состоянии и должным образом исследовать прогрессирующую мышечную атрофию и слабость, которые возникают в связи с ростом опухоли. Эта модель может помочь ответить на ключевые вопросы в области раковой кахексии о вызванной опухолью потере мышечной массы, мышечной слабости, повышенном мышечном катаболизме и гипервоспалительных уровнях цитокинов. Основное преимущество этой экспериментальной модели заключается в том, что изменения, согласующиеся с кахектическим фенотипом, могут быть легко начаты в нестационарном поместье по мере увеличения интенсивности истощения.

Эти процедуры будут демонстрировать Рафаэль Баррето, техник из моей лаборатории, и Джозеф Руперт, аспирант из группы Терезы Циммер. Для имплантации опухолей C 26 используют стерильный инсулиновый шприц диаметром в один миллиметр, оснащенный иглой 26 калибра, для быстрого введения от одного раза до 10 до шестой клетки подкожно и межлопаточно в жировые пакеты отдельных взрослых мышей. Верните животных в клетку после инъекции опухоли, под наблюдением.

Проверка мышей и ежедневная запись веса их тела. Когда потеря массы тела у опухолевого хозяина, по сравнению с контрольными животными, достигает 5, 10 или 15% по сравнению с их первоначальной массой тела, отбирают от одного до одного пункта 5 миллилитров крови путем пункции сердца и переносят отдельные образцы крови в пустые 18-миллиграммовые пробирки с калием ЭДТА. Поместите трубки на лед, пока не соберется вся кровь.

Затем центрифугируйте образцы, собирая плазму и сыворотку в конце центрифугирования. Чтобы избежать дальнейшего загрязнения, распылите 70% этанол по всему телу. Затем поместите животное на кушетку для вскрытия на спине в положении лежа на спине, а одну заднюю конечность прикрепите к приподнятому зажиму для бюретки, чтобы вытянуть конечность вертикально.

С помощью щипцов Дюмона захватите поверхностную кожу задней конечности и с помощью изогнутых тонких ножниц аккуратно удалите кожу и фасцию, обнажив нижележащие мышечные животы нижней конечности. Определите икроножную мышцу на задней нижней конечности по ее зарождению в латеральном и медиальном мыщелках на задней бедренной кости и ее прикреплению в пяточной кости, флакону с пяточным сухожилием. С помощью щипцов захватите дистальный конец икроножной мышцы и подтяните мышечный живот к его истоку.

Затем с помощью ножниц разрежьте мышцу у ее начала, как можно ближе к бедренной кости и перенесите мышцу в предварительно взвешенную посуду. Немедленно взвесьте чашку и перенесите мышцу в предварительно помеченную криопробирку. Затем определите переднюю большеберцовую мышцу от ее начала на переднебоковой поверхности большеберцовой кости и ее прикрепления к медиальной клинописи через дистальное сухожилие.

Затем возьмитесь за пальцы указательным и большим пальцами стопы и введите кончик щипцов Дюмона непосредственно под поверхностное дистальное сухожилие большеберцовой кости. Переместите щипцы таким образом, чтобы тупая сторона могла быть использована для отделения живота большеберцовой мышцы от основной соединительной ткани, и используйте тонкие изогнутые ножницы, чтобы разрезать дистальное сухожилие. Затем разрежьте мышцу в самом начале, как можно ближе к большеберцовой кости.

Когда все мышцы будут собраны, погрузите нижнюю половину пластикового стакана объемом 50 миллилитров, содержащего изопентан, в жидкий азот. Когда изопентан станет слегка вязким, а внутри стакана будет видна сплошная белая ламинатная подкладка, налейте несколько капель закладочной среды на патрон. Затем возьмите мышцу за сухожилие и осторожно расположите конец свежей мышцы поверх встраиваемой среды.

Держа его вертикально, относительно пробки. Затем, удерживая мышцу вертикально, опустите патрон и прикрепленную мышцу в ванну с изопентаном на 7-15 секунд до полного замерзания ткани. Хорошо замороженный экземпляр будет выглядеть меловым белым.

Затем поместите мышцу в пробирку для образцов для немедленного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Для сохранения РНК и ферментативной структуры и образцов большеберцовой кости требуется заморозить мышечные ткани как можно скорее после их извлечения. Чтобы разрезать замороженную мышечную ткань, сначала установите рабочую температуру внутренней камеры криостата на отрицательные 23 градуса по Цельсию.

Дайте образцу с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия акклиматизироваться до рабочей температуры в течение нескольких часов. Затем получите несколько срезов образца толщиной восемь микрон в средней части живота мышцы, перпендикулярно оси крепления. Сбор разрезов на стеклах комнатной температуры по мере их резки.

Храните образцы в камере Cryostat до тех пор, пока не будут собраны все срезы. Затем храните образцы при отрицательной температуре 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа. Кинетика роста опухоли C 26 демонстрирует фазу задержки в течение первых семи-восьми дней после инъекции, за которой следует экспоненциальный рост клеток в течение четырех-пяти дней.

При этом масса опухоли в конечном итоге достигает примерно 10% от массы тела животного. Мыши-носители опухолей выглядят истощенными и демонстрируют растрепанный мех в конце экспериментального периода. Со снижением массы скелетных мышц на 20-30%.

Сердечная мышца также значительно уменьшается в весе. Хотя и в меньшей степени по сравнению с остальными мышцами. Интересно, что гепатомегалия и спленомаглия также обычно обнаруживаются у опухолевых хозяев.

В то время как жировая масса, подобно скелетной мышечной массе, сильно истощена. Потеря веса скелетных мышц также согласуется с уменьшением размера мышечных волокон и пропорциональна им. По данным иммунофлуоресцентной морфометрической оценки площадей поперечного сечения мышечных волокон.

В частности, анализ распределения частот демонстрирует сдвиг в сторону волокон меньшего размера у мышей C 26. Предполагается, что вся мышца подвергается атрофии при наличии опухоли C 26. Аналогичные результаты можно наблюдать и при анализе HNE.

Хотя величина изменения в площади поперечного сечения мышц, связанная с ростом рака, немного отличается. Правильное использование модели C 26 позволяет исследовать кахексию, вызванную опухолью. Модель очень похожа на болезнь человека, демонстрируя общее снижение массы, а также атрофию мышечных волокон, воспаление и гиперкатаболизм.

При проведении этого эксперимента можно модифицировать штамм шести мышей, источник и количество опухолевых клеток, а также место имплантации. Такие изменения могут привести к различиям в ожидаемых результатах. Несмотря на некоторые известные ограничения, такие как нефизиологическая среда роста, зависимость от действия IL six и необходимость использования мышей CD two F one или Valve C, модель C 26 внесла значительный вклад в понимание молекулярных механизмов раковой кахексии.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как воспроизвести модель раковой кахексии C 26 для изучения прогрессирующей мышечной атрофии и слабости, которые обычно возникают одновременно с развитием опухоли. Имейте в виду, что работа с моделью C 26 требует знакомства с правильными методами обращения с животными. Всегда следует использовать передовые методы для максимально гуманного выполнения этого протокола.