Разработка и внедрение автоматизированной освещая, культивированием и система отбора проб для микробного оптогенетика приложений

Общая цель этой процедуры заключается в сборке сосуда непрерывного культивирования, в котором реакция на освещение оптогенетических микробов может быть измерена с помощью микроскопа автоматически в режиме реального времени и в течение нескольких дней. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии и метаболической инженерии, например, как динамическая экспрессия генов может вызывать реакции, которые отличаются от статической экспрессии генов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что непрерывное культивирование позволяет проводить измерения в течение нескольких дней.

Для начала припаяйте линию заземления, линию передачи данных и линию положительного напряжения цифрового термометра к печатной плате. Отрежьте один штифт от гнездового трехконтактного разъема и обрежьте оставшиеся два контакта. Припаяйте его в пару отверстий с маркировкой R2 и соедините два припаянных контакта, вставив резистор на 4,7 килоом Ом в контактный разъем.

Далее подключаем оставшиеся компоненты к печатной плате. Наложите печатную плату на микроконтроллер. Установите светонепроницаемый корпус и установите все программное обеспечение, как описано в прилагаемом текстовом протоколе.

Сначала поместите длинный конец алюминиевого порта через прокладку в емкость для культивирования и закрутите крышку. Закройте одно короткое алюминиевое отверстие силиконовой трубкой среднего диаметра. Заглушите дистилляционный конец, вставив замок Люэра с внутренней резьбой, а затем подключив вилку замка Люэра с наружной резьбой.

Эта розетка является дополнительной и не будет использоваться. Соедините два коротких отрезка силиконовой трубки среднего диаметра с наружными и внутренними замками Люэра. Затем подключите один конец к короткому алюминиевому выходному отверстию и заткните конец дистилляции.

Сосуд будет инокулирован через эту трубку. Затем подсоедините две средние трубки к концам перистальтических трубок и соединителей среднего диаметра. Подключите один конец к короткому алюминиевому порту, а другой заткните вилкой.

Позже он будет подключен к колбе для носителей. Подсоедините силиконовую трубку среднего диаметра к самому длинному алюминиевому порту. Длина трубки должна быть достаточной для того, чтобы доставать до колбы со средой.

Подсоедините еще один короткий отрезок длиной в несколько дюймов к концу, а затем вставьте его в резиновую пробку на колбе со средой. Зажмите трубку. Когда позже это соединение разжимается, это соединение позволяет смешивать, аэрировать культуру и поддерживать положительное давление поступающих пузырьков.

Вставьте трубку среднего диаметра достаточно длинную, чтобы доставать до дна колбы, в пробку, через которую будет передаваться среда. Подсоедините к этой трубе еще одну трубку среднего диаметра, а затем трубку широкого диаметра на конце. Закупорьте дистиллятор.

Заполните третье отверстие в пробке коротким сегментом трубки среднего диаметра, соединенным с двумя другими сегментами трубки среднего диаметра, и закупорьте его на конце дистилляции. Он будет подключен к вакуумному насосу, а позже к аквариумному насосу. Вставьте замок Люэра с наружной резьбой в сегмент силиконовой трубки узкого диаметра, а затем плотно вставьте трубку из ПТФЭ.

Затем прикрепите гнездовой замок Люэра к трубке среднего диаметра. Проденьте гнездовой замок вдоль трубки из ПТФЭ, чтобы соединить замки, а другой — к короткому алюминиевому порту. Убедитесь, что трубка из ПТФЭ внутри емкости для культивирования свисает ниже второй по длине алюминиевой трубки и выше дна.

Обрежьте по мере необходимости. Отсюда отбор проб из среды будет осуществляться в канал визуализации, а узкая трубка сводит к минимуму промежуточный объем. Затем подсоедините открытую узкую силиконовую трубку к узкой перистальтической трубке и соединителям.

Для этого соедините три сегмента трубки узкого диаметра и два сегмента трубки из ПТФЭ, чередуя их. Подсоедините его к колбе для сточных вод с помощью трубки среднего диаметра. Затем подсоедините один конец силиконовой трубки среднего диаметра ко второй по длине трубке алюминиевого порта на другом конце колбы для сточных вод.

Эта алюминиевая трубка задает объем культуры, а излишки культуры переливаются в емкость для сточных вод. Оберните крышки колбы алюминиевой фольгой, а затем автоклавируйте сборку в течение 30 минут при температуре 121 градус Цельсия и 15 градусах Psi. Прикрепите вакуумный фильтр к бутылке объемом 100 миллилитров.

Снимите крышку соска, а затем стерильным пинцетом извлеките белую пробку из ниппеля вакуум-фильтра. Подсоедините широкую силиконовую трубку к ниппелю, другую свободную трубку колбы для фильтрующего материала к вакуумному насосу и убедитесь, что третья трубка, соединяющая колбу с емкостью для культивирования, зажата. Заполните фильтр наполнителем, включите вакуумный насос, а затем отфильтруйте остальные фильтрующие материалы.

Зажмите силиконовую трубку среднего размера, подключенную к вакууму, и выключите вакуумный насос. Снимите люэры с промежуточного сегмента средней силиконовой трубки, подключенной к вакуумному насосу, и вставьте в эту трубку синий конец стерильного шприцевого воздушного фильтра. Затем зажмите широкую силиконовую трубку и отсоедините от нее мужской луэр

Отсоедините заглушку от внутренней мембраны входной трубки фильтрующего материала емкости для культивирования. Подключите эти люэры, чтобы обеспечить закачку среды в емкость для культивирования. Затем снимите фильтр со 100-миллилитровой бутылки и прикрепите крышку бутылки.

Используйте эту среду для приготовления закваски. Установите узел непрерывного культивирования рядом с микроскопом так, чтобы колба для фильтрующего материала находилась выше емкости для культивирования, а колба для сточных вод ниже емкости для культивирования, чтобы предотвратить обратный поток. Надежно закрепите резиновые пробки на фильтрующем материале и флягах для сточных вод.

Далее отсоедините концы трубки из ПТФЭ от соединяющей их узкой силиконовой трубки и вставьте эти концы во входное и выходное отверстие подготовленного микрофлюидного устройства. Затем протолкните фильтрующий материал в емкость для культивирования, подсоединив белый конец воздушного фильтра шприца к аквариумному насосу. Когда среда достигнет уровня дренажного отверстия, оберните входную трубку и соединители среднего фильтрующего материала вокруг медленного перистальтического насоса, а узкие выходные трубки и соединители — вокруг быстрого перистальтического насоса.

Проветривайте фильтрующий материал, разжав воздушную трубку между колбой для фильтрующего материала и емкостью для культивирования. Затем прикрепите грелку и термометр к емкости для культивирования, чтобы можно было контролировать ее температуру. Намотайте трубки для фильтрующего материала вокруг емкости для культивирования, чтобы входящая среда имела ту же температуру, что и емкость.

Затем вставьте емкость для культивирования в корпус из черного пенопласта поверх светодиодной матрицы и убедитесь, что трубки не защемлены. Используйте плагин контроллера биореактора, чтобы включить медленный насос на одну десятую от каждых 30 секунд. Скорость потока будет очень низкой, но больше, чем скорость испарения.

Зажмите входную воздушную трубку между колбой для фильтрующего материала и емкостью для культивирования. С помощью пипетки введите в сосуд для культивирования один миллилитр из закваски. Затем зажмите дистилляционный конец этой трубки и разжмите воздушную трубку.

Дайте культуре вырасти за одну ночь. Накройте корпус так, чтобы свет не попадал внутрь. На следующий день с помощью плагина контроллера биореактора настройте перистальтические насосы на вращение в течение большей доли времени, соответствующего требуемой среде и расходу пробы.

Дайте плотности культуры уравновеситься в течение ночи. На следующий день заполните список позиций ступени и микроменеджера набором неперекрывающихся позиций, где клетки, закачанные в микрофлюидный канал, будут находиться в фокальной плоскости. Затем откройте плагин контроллера биореактора.

Выберите нужный временной ход светодиодной матрицы, каналы изображения и другие экспериментальные настройки из подсказок, а затем начните сбор данных. Этот аппарат был использован для стимуляции культуры saccharomyces cerevisiae, экспрессирующей желтый флуоресцентный белок в ответ на синий свет через индуцируемую оптогенетическую систему транскрипции. Были получены базовые контрастные и флуоресцентные изображения микрофлюидного канала.

Контуры клеток были идентифицированы по фазово-контрастным изображениям, сопоставлены с флуоресцентными изображениями, а флуоресцентные изображения были записаны в режиме реального времени. Тепловая карта здесь показывает распределение флуоресценции культуры за счет образования желтого флуоресцентного белка при активации оптогенетической системы. Флуоресценция примерно 170 000 клеток была проанализирована на основе более чем 30 000 изображений, полученных с 28 сценических положений в течение 70 часов.

Во время этого исследования культура подвергалась воздействию синего света различной интенсивности в течение шести часов, после чего в течение шести часов наблюдалась полная темнота. Клетки подвергались воздействию света до первого измерения, поэтому интенсивность флуоресценции снижается в течение первого темного периода. После освоения этой техники ее можно выполнить за восемь часов, в течение трех дней, если она выполнена правильно.

При попытке проведения этой процедуры очень важно использовать стерильную технику. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как управление обратной связью в реальном времени, для контроля концентрации белка. Этот метод позволит изучать организмы с оптогенетическими конструкциями динамически, в течение более длительных периодов времени, дольше, чем это возможно при использовании планшетов или периодической культуры.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как интегрировать аппарат непрерывного культивирования, свет и микроскоп для стимуляции и изучения оптогенетических микробов.