Оптимизация количественного микро-анализ нейтрализации

Общая цель данного анализа микронейтрализации состоит в том, чтобы охарактеризовать все типы циркулирующих в настоящее время вирусов гриппа, а также активность антител и противовирусные измерения количественным, высокопроизводительным и высокочувствительным образом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусологии, такие как антигенная характеристика вирусов гриппа, количественная нейтрализация антител и противовирусная активность. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она характеризует всю инфицированную клеточную популяцию, включая видимые и невидимые бляшки, а также одноклеточные инфекции.

Анализ микронейтрализации будет продемонстрирован доктором Ипу Линь, помощником директора Сотрудничающего центра ВОЗ по гриппу в Лондоне. Уровень биобезопасности, или BSL, для следующего протокола — BSL 2 для вирусов сезонного гриппа и BSL 3+ для потенциальных вирусов пандемического гриппа. Для начала распределите достаточное количество клеток в 96-луночные планшеты.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение двух-трех дней, чтобы достичь слияния. Используя 70% этанол, простерилизуйте многолуночную мойку пластин и используйте PBS или VGM для ее промывки. Затем используйте 200 микролитров среды для роста вируса, или VGM, для промывания сливающихся клеток.

Отсадите VGM из клеток, и сразу же добавьте по 50 микролитров VGM в каждую лунку. Далее добавьте по 900 микролитров VGM в каждую из шести стерильных пробирок. Затем нанесите пипеткой 100 микролитров вируса в первую пробирку и хорошо перемешайте.

Готовьте серийные разведения вируса, начиная с первой пробирки, меняя кончики между каждым разведением. Добавьте по 50 микролитров каждого разведения вируса, начиная с самого высокого разведения, чтобы дублировать лунки 96-луночного планшета. Затем поместите пластину при температуре 37 градусов Цельсия на два-три часа, чтобы вирус мог заразить клетки.

После подготовки накладки согласно текстовому протоколу извлеките инокулюм из лунок. Затем добавьте по 200 микролитров накладки в каждую лунку и спокойно инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Добавьте в лунки 200 микролитров ледяного 4% PFA в PBS A и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут или при комнатной температуре в течение 20 минут.

После инкубации аспирируйте PFA и используйте 200 микролитров PBS A на лунку, чтобы дважды промыть пластину. Добавьте в тарелку 100 микролитров буфера для пермеабилизации, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем используйте PBS A, чтобы дважды вымыть тарелку.

Далее добавьте в лунки по 50 микролитров мышиного моноклонального антитела против гриппа типа А, и инкубируйте при комнатной температуре с встряхиванием в течение одного часа. После инкубации используйте 300 микролитров промывочного буфера, чтобы промыть лунку три раза. Затем добавьте 50 микролитров конъюгированного вторичного антитела HRP для коз в образцы и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа.

Промыв лунки три раза, как и раньше, добавьте 50 микролитров субстрата в лунку, и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут или до тех пор, пока не станет хорошо видно развитие синего цвета. Чтобы остановить реакцию, используйте 200 микролитров дистиллированной воды, чтобы дважды промыть лунки. Затем, после сушки тарелки на воздухе, храните ее в темном месте.

Поместите пластину лунки в область сканирования планшетного сканера, используя L-образный предел положения, чтобы обеспечить оптимальное и воспроизводимое местоположение изображения. Отсканируйте пластину с помощью настроек, показанных здесь. Затем запустите программное обеспечение для чтения скважинных планшетов, чтобы рассчитать необходимую концентрацию вируса, нажав кнопку «Загрузить изображение», чтобы загрузить изображение.

Затем на вкладке глобального порога сдвиньте красную полосу на гистограмме, чтобы настроить порог выборки. Затем нажмите кнопку обновления, чтобы проверить эффект на изображении. Теперь поставьте галочку в поле «Рассчитать нейтрализацию/титрование».

Нажмите кнопку «Выборка», чтобы количественно оценить популяцию инфицированных клеток, или ICP. Затем при появлении запроса нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить результаты выборки. Чтобы получить результаты титрования, загрузите или введите карту определения пластины скважины.

В поле Титрация:Оптимальная популяция вируса укажите пороговое значение. Перейдите на вкладку «Процесс титрования», чтобы рассчитать результаты титрования. Затем проверьте результаты титрования, прежде чем нажать кнопку «Сохранить и закрыть», чтобы сохранить результаты.

Обратитесь к приложению S1 для получения более подробной инструкции по работе с программным обеспечением. Чтобы провести обезвреживание вируса, подготовьте клеточный монослой за два-три дня. Затем добавьте по 50 микролитров VGM в каждую лунку пластины.

Используйте столбцы 11 и 12 для борьбы с вирусом и контроля клеток соответственно. Добавьте 50-микролитровые аликвоты одного к 20 разведению фермента, разрушающего рецепторы, или RDE, обработанной сыворотки в первый ряд столбцов от одного до 10. Выполните двукратное серийное разведение, переместив 50 микролитров из строки A в строку H и отбросив 50 микролитров из строки H. Затем добавьте по 50 микролитров разбавителя в каждую лунку контрольной колонки клеток.

Добавьте по 50 микролитров вируса в каждую лунку пластины, кроме контрольной колонки клеток. Выдерживайте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех часов. Затем удалите инокулянт и добавьте накладку в каждую лунку.

Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия без помех. Затем зафиксируйте и окрасьте пластины, как показано ранее в этом видео. Чтобы количественно оценить нейтрализацию, поместите планшет для лунок в область сканирования планшетного сканера, как было показано ранее в этом видео.

Отсканируйте планшет и запустите программное обеспечение для чтения скважинных планшетов, чтобы рассчитать необходимые титры вирусов, как и раньше. После загрузки или ввода карты скважинной пластины, в разделе Нейтрализация:Вычет инфекции укажите пороговое значение. Затем выберите «Процесс нейтрализации», чтобы рассчитать титры.

Наконец, проверьте титры и нажмите кнопку «Сохранить и закрыть», чтобы сохранить результаты нейтрализации. Здесь представлены результаты титрования в ходе недавних экспериментов по определению характеристик антигенов восьми входных вирусов с разведениями от 1,0 до 10 до отрицательного значения до 1,0 до 10 до отрицательных шести. На графике показано, что ВЧД снижаются с увеличением разведения вируса.

Кривые были нормализованы по отношению к ВЧД тех же вирусов, которые вызывали инфекции во всех клетках лунки. В этой таблице перечислены разведения вирусов, которые произвели 30% насыщения ICP, которые были выбраны в качестве входного разведения вируса для нейтрализации. На этом рисунке представлены результаты эксперимента по нейтрализации с использованием одного входного вируса против пяти антисывороток.

На графике показан инфекционный процесс с увеличением разведения сыворотки крови. Нормализованная положительная популяция по вертикальной оси представляет собой отношение ВЧД от соответствующего антисывороточного ответа к среднему ВЧД референсного вируса. Наконец, титры нейтрализации определяли как величины, обратные разведениям антисыворотки, соответствующим 50%-ному снижению ВЧД.

Этот анализ фокусируется на согласованности, скорости и чувствительности обнаружения, включая количественное титрование входных вирусов, высокопроизводительную визуализацию и обработку данных. Он экономически эффективен, удобен в использовании и регулярно используется в исследованиях вирусных антигенов.