Изучение эндоплазматического ретикулума и митохондрии взаимодействий путем В Ситу Пробирной Расстояние Лигирование в Фиксированные клетки
10 декабря 2016 г.
Здесь мы опишем процедуру визуализации и количественной оценки с высокой чувствительностью эндогенные взаимодействия между эндоплазматического ретикулума и митохондрий в фиксированных клетках. Протокол оснащен оптимизированной Ситу лигирования анализа близости в ориентации инозита 1,4,5-трифосфат / белок глюкозы регулируемого рецептора 75 / зависящие от напряжения анион канала / циклофилин D комплекса на границе раздела мембраны митохондрии-ассоциированной.
Общая цель этого эксперимента заключается в визуализации и количественной оценке взаимодействий митохондрий эндоплазматического ретикулума с использованием анализа близкого лигирования in situ в фиксированных клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биомедицинской области, чтобы лучше проанализировать взаимодействия митохондрий ER в фиксированных клетках с помощью простого метода иммунофлуоресценции. Надеюсь, предложу новые стратегии лечения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем визуализировать и количественно оценить взаимодействия митохондрий ER в фиксированных клетках, и этот метод может быть применен к биопсии тканей пациентов, залитых парафином. С помощью анализа близкого лигирования in situ, продемонстрированного в этом видео, первичное антитело мыши, направленное против VDAC1 на внешней митохондриальной мембране, и первичное антитело кролика, направленное против IP3R1 на мембране эндоплазматического ретикулума, объединяются со своими эпитопами, находящимися вблизи на границе митохондриальной мембраны. Зонды бесконтактного лигирования, к которым прикреплены концевые хвосты ДНК и которые направлены против IgG мыши и кролика, могут образовывать матрицы для лигирования олигонуклеотидов коннектора и могут быть амплифицированы и визуализированы с использованием техасских красных олигонуклеотидов. В соответствии с расстоянием между обоими мембранами органелл, на границе митохондриальной ассоциированной мембраны. Для фиксации и блокирования клеток для анализа бесконтактного лигирования in situ поместите клетки H7 человека в 150 000 клеток на некодированную чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм. На следующий день удалите питательную среду и используйте 1 мл PBS для промывания клеток. Затем аспирируйте буфер и добавьте 1 мл десятипроцентного формальдегида. Инкубируйте планшеты при комнатной температуре с помешиванием в течение 10 минут для фиксации клеток. Чтобы остановить реакцию, добавьте 1 мл 1 М глицина и перемешайте пластины вращением. Удалите раствор глицина и добавьте 1 мл 1XPBS. Затем кратковременно взбалтируйте пластины и аспирируйте буфер. Далее добавьте в клетки 1 мл 100 мМ глицина. Инкубируйте пластины при комнатной температуре с перемешиванием в течение 15 минут. После аспирации раствора проникните клетки, добавив 1 мл 0,1% тритона-Х100 в PBS. И повторите инкубацию. Аспирируйте моющее средство и добавьте 1 мл PBS для промывания клеток. После удаления буфера добавьте по 40 микролитров блокирующего раствора в каждую чашку с клетками и инкубируйте образцы во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем смахните блокирующий раствор с посуды, стараясь получить равные остаточные объемы буфера для каждой горки, не позволяя слайдам высохнуть. Для проведения анализа на бесконтактное лигирование используйте PBS для разбавления первичных антител. Вортексируйте и добавьте раствор в посуду. Инкубируйте образцы при 4
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена процедура высокочувствительной визуализации и количественной оценки взаимодействий между эндоплазматическим ретикулумом и митохондриями в фиксированных клетках. Метод основан на использовании оптимизированного анализа лигации близости in situ для выявления специфических белковых комплексов на интерфейсе митохондриально-ассоциированных мембран.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Биохимия
Теоретическая база
- Эндоплазматический ретикулум и митохондрии играют ключевую роль в клеточном метаболизме.
- Понимание их взаимодействий необходимо для выяснения клеточных функций.
- Метод анализа лигации по близости представляет собой чувствительный способ изучения белковых взаимодействий.
- Данное исследование сосредоточено на специфическом белковом комплексе, участвующем в этих взаимодействиях.
Цель исследования
- Разработать метод визуализации взаимодействий между ЭР и митохондриями.
- Количественно оценить эти взаимодействия с высокой чувствительностью.
- Углубить понимание клеточного метаболизма и передачи сигналов.
Используемые методы
- Метод анализа близости (proximity ligation assay) in situ
- Таргетинг рецептора инозитол-1,4,5-трифосфата
- Участие глюкозо-регулируемого белка 75
- Анализ комплекса вольтаж-зависимого анионного канала и циклофилина D
Основные результаты
- Успешная визуализация взаимодействий между ЭР и митохондриями.
- Количественная оценка белковых комплексов на мембранном интерфейсе.
- Демонстрация высокой чувствительности при детектировании взаимодействий.
Выводы
- Разработанный протокол позволяет детально изучить клеточные взаимодействия.
- Полученные данные могут способствовать пониманию метаболических процессов.
- Данный метод может быть применен в различных областях биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная оценка эндогенных взаимодействий между ЭР и митохондриями имеет решающее значение для снижения рисков при проверке гипотез на ранних этапах поиска, связанных с клеточной сигнализацией и метаболической регуляцией. Метод анализа лигации вблизи in situ обеспечивает чувствительную мультиплексную детекцию сайтов контакта органелл без гиперэкспрессии белков, что повышает прогностическую уверенность в системах, имеющих отношение к заболеванию. Эта возможность укрепляет обоснованность принятия решений по портфелю проектов на стыке валидации мишеней и анализа механизмов функционирования путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает прямую визуализацию и количественную оценку контактов ЭР-митохондрий на молекулярном уровне.
- Поддерживает снижение механистических рисков путем подтверждения сближения эндогенных белков в фиксированных клетках и биоптатах тканей.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для путей, включающих кальциевую сигнализацию и перекрестное взаимодействие органелл.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней, участвующих в метаболических и сигнальных расстройствах.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированный, воспроизводимый анализ для количественной оценки белок-белковых взаимодействий с суб-органеллярным разрешением.
- Позволяет проводить тестирование в нескольких условиях для оценки влияния соединений или генетических пертурбаций на контакты между ЭР и митохондриями.
- Предоставляет количественные данные, пригодные для сравнительного анализа различных экспериментальных групп.
- Поддерживает масштабируемость анализа и повторное использование платформы для более широких инициатив по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует системам, имеющим значение для заболевания, за счет возможности проведения анализа на биоптатах тканей пациентов.
- Обеспечивает трансляционную непрерывность — от этапа открытия до доклинической валидации мишеней взаимодействия органелл.
- Поддерживает продвижение с учетом рисков, предоставляя механистические доказательства задействования сигнального пути.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод анализа близости с помощью лигирования in situ связывает этап ранних открытий и доклинические исследования, позволяя проводить надественный количественный анализ взаимодействий между ЭР и митохондриями в фиксированных клетках и тканях.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей механизмов взаимодействия органелл.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для кампаний по скринингу соединений или генетическому скринингу.
- Аналитика: обеспечивает чувствительное обнаружение близости белков на расстоянии менее 40 nm, что позволяет проводить статистическое сравнение частоты взаимодействий.
- Трансляционные исследования: способствует сопоставлению биомаркеров и механистической валидации в образцах, имеющих значение для изучения заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: предоставляет многократно используемую платформу для различных исследований белковых взаимодействий в рамках нескольких программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует определение эндогенных белковых взаимодействий с высокой чувствительностью и специфичностью.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки за счет получения надежных механистических данных на ранних этапах процесса.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению мишеней с валидированными профилями взаимодействий с органеллами.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с протоколами иммунофлуоресценции и анализа лигации вблизи (PLA).
- Необходим доступ к высококачественным антителам и инфраструктуре для флуоресцентной визуализации.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости количественного анализа в различных исследованиях.
- Метод применим как к клеточным линиям, так и к биопсийным образцам тканей, фиксированным в парафине, что важно для трансляционных исследований.
- Ограничено использованием фиксированных образцов; не подходит для изучения динамического взаимодействия в живых клетках.
