Быстрое Нейрональная Дифференциация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки для измерения сетевой активности на микро-электродных Массивы

Мы модифицируем и реализовать ранее опубликованный протокол , описывающий быстрое, воспроизводимое и эффективное дифференцировку человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) в возбуждающих корковых нейронов ^12. В частности, наша модификация позволяет контролировать плотности нейронов и использования клеток на микро-матриц электродов для измерения электрофизиологических свойств на сетевом уровне.

Общая цель этого протокола дифференцировки нейронов заключается в быстром и контролируемом создании нейронных сетей из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, растущих на микроэлектродных массивах. Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов в области нейронауки. Он может быть использован для изучения биологических механизмов, лежащих в основе неврологических расстройств, но он также может быть использован для решения более фундаментальных нейробиологических вопросов.

Основным преимуществом данной методики является быстрая дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в нейроны контролируемым образом. В первый день нагрейте среду DMEM/F12, CDS и E8 с 1% пенициллина стрептомицином до комнатной температуры. Затем добавьте доксициклин в среду Е8 до получения конечной концентрации четыре микрограмма на миллилитр, а затем добавьте в смесь ингибитор горных пород

Аспирируйте отработанную среду RTTANGN2 положительными ИПСК и добавьте в клетки один миллилитр CDS. Впоследствии инкубируйте клетки в течение трех-пяти минут во увлажненном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия. Под микроскопом проверьте, не отделяются ли клетки друг от друга.

Затем добавьте в лунку два миллилитра DMEM/F12. Аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетки объемом 1 000 микролитров, а затем переложите в пробирку объемом 15 миллилитров. После этого добавьте семь миллилитров DMEM/F12 в клеточную суспензию и вращайте клетки при 200 x g в течение пяти минут.

Через пять минут отсадите надосадочную жидкость и добавьте два миллилитра приготовленной среды Е8. Диссоциируйте ИПСК путем приложения кончика пипетки объемом 1000 микролитров к боковой стороне пробирки объемом 15 миллилитров и осторожного суспендирования клеток. Под микроскопом проверьте, не диссоциированы ли клетки.

Затем определите количество клеток на миллилитр с помощью гемоцитометра. Для шести лунок МЭА разбавьте клетки до получения клеточной суспензии в соотношении 7,5 умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр. Для покровных прокладок разведите клетки до получения клеточной суспензии в четыре раза по 10 до четвертой клетки на миллилитр.

Аспирируйте разведенный ламинин из покровных листов и шести лунок МЕА. Для шести лунок MEA нанесите на клетки пластины, добавив 100 микролитров суспензии к активной области электродов в каждой лунке. Затем нанесите тарелки на клетки, добавив 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета.

Затем поместите шестилуночный MEA или 24-луночный планшет во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Через два часа осторожно добавьте по 500 микролитров подготовленной среды Е8 в каждую лунку из шести лунок МЭА. Затем поместите шесть лунок MEA на ночь в увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию.

На третий день подогрейте 0,05% трипсин-ЭДТА до комнатной температуры. Подогрейте DPBS и DMEM/F12 с 1% пенициллина стрептомицином до 37 градусов Цельсия. Затем аспирируйте отработанную среду культуры астроцитов крысы.

Промойте культуру, добавив пять миллилитров DPBS, и аккуратно прополощите ее. После этого аспирируйте DPBS и добавьте пять миллилитров 0,05% трипсина-ЭДТА. Осторожно взбейте трипсин-ЭДТА.

Затем инкубируйте клетки во влажном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение пяти-10 минут. Впоследствии проверьте под микроскопом, чтобы рассмотреть, не оторвались ли клетки. Отделите последние ячейки, ударив по колбе несколько раз.

Затем добавьте в колбу пять миллилитров DMEM/F12. Постарайтесь аккуратно оценить клетки внутри колбы с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. После этого соберите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Вращайте трубку при давлении 200 x g в течение восьми минут. После этого аспирируйте надосадочную жидкость, и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре DMEM/F12. Определяют количество клеток на миллилитр с помощью гемоцитометра.

Затем добавьте 7,5 умножить на 10 к четвертому астроцитам в каждую лунку из шести лунок MEA. И прибавьте два раза по 10 к четвертой астроцитам в каждую лунку 24-луночной пластины. Инкубируйте клетки в течение ночи во влажном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия.

Соберите данные с усилителем в 1 200 раз и сделайте выборку сигнала с частотой 10 килогерц с помощью платы сбора данных MCS. Запишите 20 минут электрофизиологической активности нейронов, полученных из hiPSC, культивируемых на MEA. Во время регистрации поддерживайте температуру на уровне 37 градусов Цельсия и предотвращайте испарение среды и изменения pH, обеспечивая постоянный медленный поток увлажненного газа на MEA.

После этого проанализируйте данные с помощью пользовательского программного пакета. На этом рисунке показаны изменения экспрессии нейрональных маркеров MAP2 в синапсине в процессе дифференцировки, что указывает на созревание нейронов. Этот график показывает, что экспрессия синапсинов измеряется для отдельных клеток, увеличивается в процессе дифференцировки.

Синапсин, который экспрессируется в клетках после трех недель дифференцировки, локализован совместно с PSD-95, что указывает на наличие функциональных синапсов. Здесь в разные моменты времени в процессе дифференцировки был выполнен зажим всего клеточного пятна для измерения электрофизиологической активности клеток. Клетки были способны генерировать потенциалы действия в разные моменты времени.

А процент спайковых клеток, увеличивающийся с течением времени, показывает, что большинство клеток способны генерировать потенциалы действия даже на ранней стадии дифференцировки. Патч-зажим также использовался для измерения возбуждающих постсинаптических токов, получаемых клетками. Количество входов, которые получают клетки, увеличивается в процессе дифференцировки.

Как частота, так и амплитуда возбуждающих постсинаптических токов увеличивались в процессе дифференцировки. В процессе дифференцировки измеряли электрофизиологическую активность клеток, дифференцированных на микроэлектродных решетках. Здесь активность нейронной сети увеличивалась в процессе дифференцировки и демонстрировала синхронные события через 23 дня.

После освоения эта техника может быть использована для дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в функциональные нейронные сети в течение трех-четырех недель. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости работать стерильно и обращаться с клетками бережно. После этой процедуры могут быть использованы другие методы, такие как фармакологическое тестирование, для спасения фенотипа, наблюдаемого в клеточных линиях пациентов.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейронаук к официальному изучению дефектов сетевой активности при неврологических расстройствах. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как быстро и контролируемо дифференцировать, индуцировать плюрипотентные стволовые клетки в нейроны.