Протокол по использованию Ферстер Resonance Energy Transfer (FRET) -Force биосенсоров для измерения механических сил по всему комплексу ядерного ЛИНКА

Общая цель этой процедуры заключается в определении сил, действующих на линкер цитоскелета нуклеоскелета, или комплекса LINC, с помощью микроскопии FRET в живых клетках с помощью биосенсора, разработанного для белка комплекса LINC, nesprin-2G. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области механотрансдукции, такие как силы, действующие на белки в ядре живых клеток, и как эти силы изменяются в различных условиях. Основным преимуществом этого метода является его способность измерять очень малые уровни воздействия на белки и живые клетки.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности при съемке изображений. Оптимизация мощности и усиления лазера микроскопа для получения хорошего сигнала между всеми экспериментальными группами затруднена. Для начала вырастите бластные клетки NIH 3T3 до конфлюенции от 70% до 90% в шестилуночной чашке для клеточных культур в стандартном инкубаторе для клеточных культур с регулированием температуры и CO2.

В колпаке для клеточных культур удалите среду и промойте каждую лунку примерно 1 миллилитром восстановленной клеточной среды сыворотки. Добавьте по 800 микролитров восстановленной среды для клеток сыворотки в каждую лунку и поместите шестилуночную камеру в инкубатор. Затем пипетку дозируйте 700 микролитров восстановленной среды для клеток сыворотки в 1,5 миллилитровую пробирку, помеченную L, с 35 микролитрами раствора липидного носителя, чтобы сформировать липосмесь.

Перемешайте суспензию с помощью пипетирования. Затем пипеткой введите 100 микролитров восстановленной среды для клеток сыворотки в каждую из шести пробирок объемом 1,5 миллилитра, помеченных от одного до шести. Пипетка плазменной ДНК для датчика натяжения несприна, бесголового контроля нулевого усилия несприна, mTFP1 и венеры в пробирки с первой по шестую, как описано в текстовом протоколе.

Не используйте наконечники для пипеток повторно при пипетировании различных типов ДНК. Затем нанесите пипеткой 100 микролитров липоскопии из L-образной пробирки в каждую пробирку с маркировкой и перемешайте путем повторного пипетирования, используя чистую пипетку для каждой пробирки. Выдерживайте суспензию от 10 до 20 минут.

Далее добавьте по 200 микролитров из каждой меченой пробирки в лунку подготовленной шестилуночной камеры, содержащей клетки. Пометьте верхнюю часть каждой лунки соответствующей добавленной ДНК. Затем поместите камеру с шестью лунками в инкубатор на четыре-шесть часов.

После инкубации аспирируйте среду и добавьте от одного до двух миллилитров восстановленной среды для промывания. Аспирируйте восстановленную среду для клеток сыворотки крови и добавьте по два миллилитра трипсина в каждую лунку, прежде чем поместить чашку с шестью лунками в инкубатор на пять-15 минут. Пока клетки отделяются в инкубаторе, покройте шесть смотровых чашек со стеклянным дном слоем фибронектина в концентрации 20 микрограммов на миллилитр, растворенного в фосфатно-солевом буфере.

Дайте посуде покрыть поверхность в колпаке для клеточных культур. Нейтрализуйте трипсин, добавив два миллилитра DMEM после того, как клетки отделятся. Затем переложите содержимое каждой лунки в промаркированную 15-миллилитровую центрифужную пробирку и вращайте в 90 раз больше g в течение пяти минут в центрифуге с качающимся ротором.

Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в 1 000 микролитров DMEM с помощью пипетки. Отасывайте смесь фибронектина из стеклянной посуды и пипеткой капайте 1 000 микролитров каждой клеточной суспензии на посуду. После того как ячейки осядут на дно стеклянной посуды, добавьте в каждую лунку еще по одному миллилитру среды.

Дайте клеткам прикрепиться и сцеживать датчик в клеточном инкубаторе в течение как минимум 18-24 часов. Чтобы проверить эффективность трансфекции, используйте флуоресцентный микроскоп, оснащенный частотой возбуждения около 462 нм для mTFP1 или 525 нм для Венеры. Используйте эмиссионный фильтр с центром около 492 нанометров для mTFP1 или 525 нанометров для Венеры.

Примерно через 18-24 часа после завершения трансфекции используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп для изучения эффективности трансфекции, сравнивая количество флуоресцентных клеток с общим числом рассматриваемых клеток. Если живые клетки не могут быть визуализированы в течение 48 часов после трансфекции, зафиксируйте клетки в 4% параформальдегиде в течение пяти минут. Дайте клеткам экспрессироваться сенсору за 24–48 часов до фиксации.

Сохраните ячейки в PBS и просмотрите через 48 часов. В капюшоне для клеточных культур замените клеточную среду средой для визуализации, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Поместите смотровые чашки в предметный столик конфокального микроскопа с регулируемой температурой.

Поместите стеклянную смотровую тарелку с трансфицированными клетками mTFP1 над масляным объективом с 60-кратным увеличением и числовой апертурой 1,4. Локализуйте клетки, экспрессирующие mTFP1, в широкопольном флуоресцентном режиме. При наличии флуоресцентной ячейки в поле зрения выберите режим спектрального детектирования и захватите спектральное изображение.

Включайте все частоты выше 458 нанометров с шагом 10 нанометров. Выберите яркую флуоресцентную область на ячейке. Добавьте среднее значение ROI флуоресценции в качестве нормализованной интенсивности в базу данных спектров, щелкнув Сохранить спектры в базе данных.

Оптимизируйте мощность и усиление лазера таким образом, чтобы было достигнуто хорошее соотношение сигнал/шум. Настройки будут отличаться для разного оборудования. Повторите процесс для клеток, экспрессирующих венеру, и оставайтесь в спектральном режиме.

Используйте частоту возбуждения 488 нанометров вместо 458 нанометров. При необходимости отрегулируйте параметры мощности, но не изменяйте частоту излучения. Выберите яркий флуоресцентный ROI радиусом около 20 пикселей.

Добавьте среднее значение ROI флуоресценции в качестве нормализованной интенсивности в базу данных спектров, щелкнув Сохранить спектры в базе данных. Чтобы захватить несмешанные изображения, сначала переключите режим съемки на спектральное несмешивание. Добавьте спектральные отпечатки пальцев Венеры и mTFP1 в каналы для снятия микширования.

Установите возбуждающий лазер обратно на источник аргона 458 нанометров. Поместите смотровую тарелку с датчиком натяжения несприн над масляным объективом 60X. После фокусировки на флуоресцентной ячейке с достаточно яркой выразительностью отрегулируйте усиление и мощность лазера, чтобы оптимизировать соотношение сигнал/шум.

Сделайте не менее 15–20 изображений ячеек датчика натяжения несприна с относительно одинаковой яркостью и избегайте чрезмерной насыщенности пикселей. Повторите процесс захвата изображения с безголовыми клетками с несприном, используя идентичные параметры визуализации. Здесь показано репрезентативное изображение в 10 раз увеличенных фибробластов 3T3, трансфицированных с помощью датчика натяжения несприна с использованием липидного носителя.

Как правило, только часть клеток трансфицируется в заданном поле зрения. Здесь показана репрезентативная пара из двух ядер 3T3, экспрессирующих nesprin-TS в спектрально несмешанных каналах Венеры и mTFP. Объединенное цветное изображение двух каналов отображается на правой панели.

Ниже приведена репрезентативная выборка замаскированных ядер несприн-TS из стабильных экспрессирующих клеток MDCK на структурированных и неструктурированных субстратах. Изображения отношений определяются как отношение венерианского канала, деленное на канал mTFP, и могут использоваться для сравнения относительных количественных сил. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за восемь часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательной маркировке пробирок ДНК во время трансфекции и поддерживать постоянные параметры визуализации при получении изображений со спектральными результатами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансфицировать клетки с помощью датчика натяжения nesprin и получать изображения со спектральным разрешением в компьютерный индекс FRET, который коррелирует с силой, действующей на датчик напряжения. Хотя в этом случае для несприна используется датчик FRET, он также может быть применен к другим белкам в клетке, где требуется измерение силы.