ACT-PRESTO: Биологическая ткань Очистка и иммунноокрашивания Методы визуализации Volume

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить очищенную, неповрежденную ткань и визуализировать ее трехмерную молекулярную информацию с помощью методов иммуномаркировки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и биологии развития, такие как нейронные связи, молекулярная категоризация и структурные изменения во время развития. Основным преимуществом этой методики является то, что ткань четко позволяет проводить анализ крупных образцов на субклеточном уровне без среза.

Чтобы начать эту процедуру, инкубируйте неподвижные органы в растворе гидрогелевого мономера A4P0 при температуре четыре градуса Цельсия в течение 12-24 часов с легким встряхиванием. После этого добавьте пять миллилитров раствора мономера Гидрогеля в 10 миллилитров трубки с круглым дном. Затем перенесите на него образец мозга мыши и оберните верхнюю часть пробирки парапленкой.

пузырьковый азот через жидкость с образцом мозга, настоянным гидрогелем, в течение одной минуты. Быстро и плотно закройте пробирку, содержащую образец. Перенесите трубку на водяную баню на два часа.

После этого проверьте вязкость гидрогеля, а затем кратковременно промойте полимеризованный образец 0,1 X PBS, чтобы удалить излишки гидрогеля. На этом этапе переложите полимеризованный образец в контейнер для салфеток. И поместите контейнер с салфеткой в камеру ETC.

Далее заполните камеру ETC буфером ETC с помощью перистальтического насоса. Задайте условия ETC и включите его. Срезы мозга толщиной от одного до двух миллиметров очищаются в течение двух часов.

И весь мозг достаточно очищается в течение пяти-шести часов. Затем переложите образец в коническую пробирку объемом 50 миллилитров с 45 миллилитрами 0,1 X PBS. Промойте образец несколько раз с помощью 0,1 X PBS до тех пор, пока не исчезнут пузырьки при кратковременном встряхивании пробирки, чтобы подтвердить полное удаление SDS.

Чтобы выполнить c-PRESTO, переложите небольшой образец в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 500 микролитров раствора для разведения антител с коэффициентом разведения от одного до 500 для антител к коллагену четвертого типа и центрифугируйте пробирку при 600 г в течение двух часов. После этого испачканный образец промыть 0,1 X PBS центрифугированием при 600-кратном g в течение 30 минут.

Затем добавьте 500 микролитров раствора для разведения антител с коэффициентом разведения от одного до 500 для Cy3 конъюгированного вторичного антитела Anti Rabbit и центрифугируйте его 600 раз в г в течение двух часов. Затем окрашенный образец промывают 0,1 X PBS центрифугированием при 600-кратном g в течение 30 минут. Чтобы выполнить s-PRESTO для более крупных тканей, перенесите образец в шприц, подключенный к трехходовому клапану, в положении закрытого клапана.

Добавьте от пяти до семи миллилитров раствора для разведения антител с коэффициентом разведения от одного до 500 для антител к коллагену четвертого типа. Впоследствии добавьте раствор антитела в образец, открыв клапан. Затем в положении открытого клапана установите поршень шприца в положение 17 миллилитров, чтобы обеспечить достаточное пространство для движения вывода инфузии.

Затем закройте трехходовой клапан после завершения настройки шприца. Поместите шприц с образцом на шприцевую помпу. Установите условия работы шприцевого насоса на объем забора инфузии десять миллилитров в минуту и четырехминутную паузу в режиме непрерывного цикла.

После этого запустите шприцевой насос в течение от трех до 24 часов при комнатной температуре. После этого откройте трехходовой клапан и замените раствор на 0,1 X PBS. Каждый раз дважды промойте испачканный образец 0,1 X PBS в течение одного часа с помощью шприцевого насоса.

Затем замените PBS раствором для разведения антител, содержащим конъюгированное Cy3 вторичное антитело Anti Rabbit, и запустите шприцевой насос в течение от трех до 24 часов. После этого откройте трехходовой клапан и замените раствор на 0,1 X PBS. Перед визуализацией инкубируйте окрашенный образец в соответствующем количестве кубического раствора в течение одного часа при комнатной температуре, осторожно встряхивая.

Через час замените раствор свежим кубическим раствором и инкубируйте еще час. Поскольку антитела не могут проникать в плотные ткани путем диффузии, методы иммуномечения PRESTO предназначены для активного вливания макромолекул и доставки реагентов в плотные ткани. Приложение центробежных сил с помощью стандартной настольной центрифуги заметно облегчило доставку антител.

Применение конвекционного потока с помощью шприцевого насоса также улучшило проникновение антител. Для s-PRESTO для доставки антител использовался шприцевой насос. Органы мыши, такие как почки и печень, были помечены коллагеном 4-го типа.

По сравнению с традиционными методами, три часа c или s-PRESTO значительно увеличивают глубину этикетирования. В почках и печени глубина оси Z достигает от 300 до 350 микрометров или глубже в образцах PRESTO, в то время как контрольные образцы мечаются на глубине всего от 40 до 50 микрометров. После того, как эти техники будут освоены, их можно сделать за день для тканей четко, если они будут выполнены правильно.

Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о четком соблюдении времени фиксации тканей гидрогелевым мономером, эмульсией и электрофоретической тканью. После процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммунометка, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как анализ клеточной динамики и идентификация нейронной лунки в нескольких органах. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области медицинской науки к изучению диагностики заболеваний.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как делать встраивание гидрогеля и полимеризацию тканей. Не забывайте, что работа с раствором гидрогелевого мономера может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.