Простой способ измерить изменения в Reward обращаемость за помощью Дрозофилы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы измерить самовведение этанола у плодовых мушек в качестве показателя изменений в состояниях вознаграждения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии, например, как опыт кодируется в мозге и приводит к изменению поведения. Главное преимущество этой методики в том, что она относительно проста, и не требует сложной настройки.

Протокол состоит из двух дискретных частей. Первый заключается в том, чтобы подвергнуть мух приятным и невознаграждающим переживаниям, а второй — определить добровольное потребление этанола как меру мотивации для получения вознаграждения за наркотики. Эти две части протокола могут использоваться независимо друг от друга.

Индуцировать модуляцию опыта в качестве первого шага для дальнейших последующих анализов или в качестве независимого анализа с двумя вариантами питания. Демонстрировать процедуру будут Шир Зер, студент магистратуры, и Юлия Рывкин, аспирантка, обе из моей лаборатории. Чтобы начать строительство капиллярной кормушки, сначала возьмите стандартный флакон от мухи с небольшими отверстиями вдоль боковой части флакона.

Лезвием бритвы разрежьте пробку флакона пополам, крест-накрест. Отметьте четыре точки на поверхности пробки, создав квадратную форму для расположения капиллярных держателей. Иглой 18-го калибра проделайте четыре отверстия через пробку в месте расположения меток.

И сделайте отверстия шире с помощью микропипетки. С помощью лезвия бритвы разрежьте четыре микропипетки так, чтобы они прочно удерживали пять микролитровых стеклянных капилляров. Вставьте их в отверстия в подготовленной пробке.

Отметьте на пробке положение двух капилляров, которые будут содержать этанол. Далее расположите стеклянные флаконы в микроцентрифужных стеллажах. Растопите корм от мух, а затем насыпьте по два миллилитра в каждый из флаконов.

Дайте пище застыть, а затем накройте флаконы полиэтиленовой пленкой. Начните с уединения от самцов мух, которые были размещены отдельно в меньших флаконах. Назначьте их на две группы случайным образом.

Те, кто пройдет через вознаграждающий, в отличие от невознаграждающего брачного опыта. Начиная с группы, не получающей вознаграждения, добавьте ранее спаренную самку в каждый флакон. Перейдя к группе наград, добавьте в каждый флакон по девственной самке.

Наблюдайте за брачными встречами, чтобы убедиться, что самцы, взаимодействующие с девственными самками, успешно спариваются в течение первого часа. И что самцы, взаимодействующие с ранее спаренными самками, не спариваются. Важно внимательно наблюдать, чтобы убедиться, что спаренная когорта действительно подвергается спариванию, а отвергнутая когорта не успевает спариваться.

Через час исключите из эксперимента всех самцов из отвергнутой когорты, которым удалось спариваться, и самцов из спаренной когорты, которые не смогли спариться к концу первой тренировочной сессии. Завершите сеанс кондиционирования, выведя ранее спаренных самок из состояния, не приносящего вознаграждения, сохранив этих особей для последующих испытаний. Наконец, удалите и выбросьте самок из группы спаренных самцов.

Дайте мухам отдохнуть в течение часа, а затем повторите часовой тест еще два раза с часовым отдыхом между ними. Эти тренировки следует повторять каждый день в течение еще трех дней. После заключительной сессии кондиционирования на четвертый день отсадите одиночных самцов и поместите их группами по шесть-восемь особей в капиллярные фидерные флаконы, держа мух в одной и той же группе вознаграждения вместе.

Используйте мягкую заглушку, чтобы удерживать самцов на месте во время перемещения. После того, как все мухи будут вставлены, замените мягкую пробку на пробку капиллярного питателя. Намочите пробки, аккуратно добавив пять миллилитров воды в верхнюю часть каждой пробки, не допуская попадания в флакон

Приготовьте растворы этанола и воды для пищевых продуктов, а затем поместите пять микролитровых капель на полоску лабораторной пленки. Дайте раствору заполнить капилляр до тех пор, пока он не достигнет отметки в пять микролитров. А затем аккуратно постучите ими по полоске, чтобы раствор расположился точно на заданной линии.

Запечатайте концы капилляров, окунув их в мелкие капли минерального масла. Наконец, вставьте два капилляра, содержащих этанол, и капилляры, не содержащие этанол, в адаптеры в вилке. Открытые стороны должны выступать на один миллиметр или менее от поверхности пробки.

Если отверстие для капилляров находится близко к влажной пробке, это уменьшает испарение и обеспечивает легкий доступ к пище, так как мухи обычно садятся на пробки и спускаются вниз по открытому капилляру для кормления. Кроме того, приготовьте один макет флакона без мух, который будет использоваться в качестве контроля для оценки естественного испарения. Наконец, запишите взаимное расположение жидкости в каждом из капилляров во флаконах по отношению к черной линии в миллиметрах.

Установите флаконы в экспериментальный инкубатор на 24 часа. Измерьте и запишите уровни жидкости в каждом удаленном капилляре относительно черной линии. Как только эксперимент будет завершен, заменяйте капилляр в установленное время, каждый день.

Снова смочите пробки двумя миллилитрами воды, а затем установите флаконы обратно в инкубатор. Самцы плодовых мушек дикого типа Canton S, собранные при выведении и выдержанные до четырехдневного возраста, в течение четырех дней проверялись на предмет их врожденного предпочтения к употреблению алкоголя. Анализ объемов, потребляемых из этанола и растворов, не содержащих этанол, показывает, что мухи проявляли значительное предпочтение пищевому источнику с 15% этанолом.

Эксперимент CAFE был повторен со спаренными и отвергнутыми самцами. Обе группы ранее содержались поодиночке и подвергались воздействию самок, которые либо принимали, либо отвергали спаривание. При введении группами во флаконы CAFE отбракованная группа потребляла больше из капилляров этанола.

Это говорит о том, что воспринимаемое отсутствие вознаграждения приводит к увеличению поведения, направленного на поиск вознаграждения. И наоборот, успешное спаривание повышает уровень внутреннего вознаграждения, что, в свою очередь, снижает потребление этанола. При попытке выполнить эту процедуру важно поддерживать хорошо увлажненную среду в течение всего эксперимента, уделяя особое внимание части потребления, поливая пробки каждый день и держа капиллярные концы в непосредственной близости от влажных пробок.