2D и 3D-матрицы для изучения формирования и активности линейных инвадосом
2 июня 2017 г.
В этом протоколе описывается, как подготовить двумерную смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагена I, и пробку 3D-коллагена I для исследования линейных интрадосом. Эти протоколы позволяют изучать формирование линейной инвадосомы, активность деградации матриц и возможности инвазии первичных клеток и линий раковых клеток.
Наша группа работает над взаимодействием между клеточным и внеклеточным матриксом. Клетки могут производить, но также могут разрушать элемент внеклеточного матрикса. Деградация матрикса может происходить не только во время физиологических, но и при патологических процессах, таких как нейродегенсис и инвазия клеточной опухоли.
На клеточном уровне мы можем заметить наличие актиновой структуры, участвующей в деградации матрикса. И эти структуры называются инвадосомами. Инвадосома — это общий термин, включающий подосомы в нормальных клетках и инвадоподии в раковых клетках.
Деградация этой инвадосомы может быть самоорганизованной в виде различных форм, точек, агрегатов и розеток. И активность этой инвадосомы обусловлена металлопротеиназами, такими как MMP2 и MT1-MMP. Это уже не долгое время у пары, MMP2, MT1-MMP активируется коллагеновыми фибриллами 1 типа.
Для изучения активности инвадосом был использован классический зимографический анализ in-situ. Но чтобы изучить роль и влияние коллагеновых фибрилл 1 типа на инвадосомы, мы решили создать новый анализ. Для этого мы создали смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагеновых фибрилл 1 типа.
В этом фильме в первой части Элойда Генриет покажет вам, как мы создаем этот вид матрицы. Во второй части Закария Эззухры покажет вам, как мы можем измерить влияние коллагеновых фибрилл 1 типа на морфологию, формирование и активацию инвадосом. И в последней части Джули Ди Марино покажет вам, как мы адаптируем 3D-анализ на инвазию коллагена.
Я покажу вам, как приготовить смешанную матрицу, состоящую из желатина и коллагеновых фибрилл 1 типа. Я сделаю два типа смешанной матрицы. Один из них проводит зимографию in situ с флуоресцеиновым желатином и нефлуоресцеиновым коллагеном 1 типа.
И еще одна, позволяющая визуализировать коллагеновые фибриллы с нефлуоресцеиновым желатином и мечеными коллагеновыми фибриллами. Чтобы приготовить желатиновую матрицу, апикотируйте 20 микролитров капель желатина на кусочек парапленки. Накройте каждую каплю автоклавным стеклянным покровным стеклом.
Выдерживать при комнатной температуре 20 минут и беречь от света. Для фиксации желатина в ПБС вводится 40 микролитров капель 0,5%глутаральдегида. С помощью щипцов наденьте покрытые желатином покровные стекла на каждую каплю глутаральдегида.
Выдерживать при комнатной температуре в течение 40 минут и беречь от света. Возьмите многолуночный планшет для культивирования клеток и заполните каждую лунку 500 микролитрами стерильного 1X PBS. В конце инкубационного периода поместите каждую покровную крышку желатиновой стороной вверх в каждую лунку.
Стирайте покровные стекла дважды в 1X PBS по пять минут каждый. На этом этапе покровные стекла можно использовать для экспериментов или сохранить для последующего использования. Пипетка 0,4 мг на мл коллагена по одному в пробирку.
Добавьте флуоресцентный краситель до конечной концентрации 10 мкг на мл. Смешайте раствор в пробирке и выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре, защищенной от света. Разбавьте до конечного объема 1x DPBS и добавьте 500 микролитров раствора поверх покрытых желатином покровных стекол в многолуночной пластине.
Инкубируйте в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия для полимеризации коллагена. После инкубации удаляют излишки коллагена. Добавьте клетки для конечного объема 500 микролитров и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия перед фиксацией.
Этот тип матриц может быть модифицирован другими элементами матрицы, такими как фибронектин, витронектин или коллаген IV типа. Со своей стороны, я покажу вам, как проводить иммунофлуоресценцию с помощью Tks5, маркера инвадосом, и как количественно определять линейные инвадосомы на покровных стеклах, покрытых коллагеном 1-го типа. Мы можем представить результаты по количеству клеток, присутствующих в линейных инвадосомах, но также мы можем представить количество структур в каждой клетке.
Зафиксируйте покровные стекла на 10 минут в 500 микролитрах 4% параформальдегида в PBS. Дважды промойте 1x PBS и пропитайте клетки 0,2% Triton X-100 в 1x PBS в течение 10 минут. Аликвота 50 мкл капли раствора первичного антитела в 4% БСА в 1x PBS на кусок парапленки.
Положите каждый покровный лист на каплю. Выдерживать 40 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Дважды промойте покровные листы 1x PBS и инкубируйте покровные стекла во вторичных антителах, коллоидине и красителе Хёхста в течение 30 минут в защищенном от света месте.
После инкубации дважды промыть 1x PBS, а затем промыть дистиллированной водой для удаления солей. Закрепите покровные стекла на предметном стекле с полимеризующим монтажным материалом. Перед съемкой дайте предметному стеклу высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.
Для анализа изображения получают изображение актина и Tks5 последовательно с помощью конфокального микроскопа. Чтобы количественно оценить размер и количество линейных инвадосом на клетку, используйте программное обеспечение ImageJ и предоставленный макрос. Сначала запустите макрос в ImageJ и откройте изображение актина.
После этого откройте изображение Tks5. Установите пороговое значение и примените макрос. Проанализированные результаты появятся в двух таблицах.
Количество линейных инвадосом на клетку и другая информация, такая как процентная площадь, используемая линейными инвадосомами в клетке, будут приведены в сводной таблице. Размер каждой линейной инвадосомы будет указан в таблице результатов. После количественной оценки изображений мы можем представить результаты, показав количество структур в ячейке.
Так что со своей стороны, мы адаптируем метод, чтобы продемонстрировать присутствие линейных инвадосом в 3D. Мы поняли, что гель состоит только из коллагеновых волокон, и этот анализ используется для оценки инвазии клеток в контексте коллагена. Приготовьте раствор коллагена 1 типа на льду в конечной концентрации два мг на мл.
Добавьте флуоресцентный краситель в конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Смешайте раствор и выдержите на льду в течение пяти минут в защищенном от света месте. После этого добавьте 50 микролитров ледяного 10x PBS.
Затем добавьте 6,25 микролитров ледяного одного моляра гидроксида натрия. Добавьте стерильную воду для получения нужной концентрации и перемешайте раствор. Поместите вкладыши из камеры Бойдена в многолуночную чашку для культивирования клеток.
Добавьте по 100 микролитров коллагена по одному раствору в каждую вставку. Чтобы полимеризовать коллагеновый гель, выдержите чашку в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте обогащенную сывороткой среду для клеточных культур в каждую лунку и поместите вкладыши в среду.
Поместите 30 000 клеток в среду, не содержащую сыворотки, поверх коллагенового геля. Чтобы закрепить клетки, добавьте в пустую лунку 4% раствор параформальдегида. Удалите клеточную среду из вставки, не прикасаясь к коллагеновому гелю.
Поместите вставку в лунки с 4% раствором параформальдегида и добавьте еще 4% раствор параформальдегида поверх коллагенового геля. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. После фиксации удалите 4% раствор параформальдегида и промойте 1x PBS.
После умывания коллагеновый гель должен стать прозрачным. Теперь вставки готовы к иммунофлюоресценции. Сначала слейте воду со вставок.
Затем поместите вставки в новые лунки многолуночной пластины. Чтобы проникнуть в клетки, добавьте раствор 0,2% Triton X-100 в 1X PBS поверх коллагенового геля на 30 минут. Слейте воду со вставок.
Умойтесь 1X PBS и добавьте первичный раствор антител поверх коллагенового геля на один час в защищенном от света месте. Удалите первичный раствор антитела, промойте 1X PBS и инкубируйте коллагеновый гель с раствором вторичного антитела в течение 1,5 часов в защищенном от света месте. Смойте раствор вторичного антитела 1X PBS.
Чтобы подготовить коллагеновый гель к монтажу, разрежьте скальпелем мембрану вставки. Поместите коллагеновый гель, прикрепленный к мембране, в стеклянную посуду с дном. Важно, чтобы верхняя часть геля соприкасалась с дном посуды.
Добавьте монтажный носитель и покровное стекло сверху для наблюдения за микроскопией. С помощью этого анализа мы продемонстрировали ключевую роль рецептора DDR1 в инвазии клеток в коллагеновом геле. Этот анализ также может быть использован для оценки влияния лекарственных препаратов на клеточную инвазию.
В нашем другом исследовании мы продемонстрировали, что простое добавление нового элемента внеклеточного матрикса в его физиологическое подтверждение, в данном случае коллагеновых фибрилл 1-го типа, может изменить морфологию, молекулярный состав и активность инвадосом. Таким образом, используя различные анализы, описанные в этом фильме, мы продемонстрировали существование новых структур, новой организации инвадосом, которую мы назвали линейными инвадосомами. Создавая сложные и более физиологичные матрицы, мы позволяем идентифицировать новые пути присоединения, миграции и инвазии клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается приготовление двухмерной (2D) смешанной матрицы из желатина и коллагена I, а также трехмерного (3D) коллагенового плага I для исследования линейных инвадосом. Исследование сосредоточено на формировании инвадосом, деградации матрикса и инвазивных способностях как первичных клеток, так и линий раковых клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Взаимодействия с внеклеточным матриксом
- Исследования рака
Теоретические сведения
- Клетки способны синтезировать и расщеплять компоненты внеклеточного матрикса.
- Деградация матрикса играет важную роль как в физиологических, так и в патологических процессах.
- Инвадосомы представляют собой актин-зависимые структуры, участвующие в расщеплении матрикса.
- К этим структурам относятся подосомы в нормальных клетках и инвадоподии в раковых клетках.
Цель исследования
- Подготовить смешанный матрикс для изучения формирования инвадосом.
- Оценить активность деградации матрикса.
- Оценить инвазивные способности различных типов клеток.
Используемые методы
- Подготовка 2D-смешанного матрикса из желатина и коллагена I.
- Создание 3D-плага из коллагена I.
- Исследование формирования линейных инвадосом.
- Анализ инвазивных способностей первичных клеток и линий раковых клеток.
Основные результаты
- Успешное приготовление матриц для изучения инвадосом.
- Продемонстрированная активность клеток по деградации матрикса.
- Выявление различий в инвазивных способностях разных типов клеток.
- Полученные данные о роли инвадосом в инвазии раковых клеток.
Выводы
- Данные протоколы позволяют детально изучить динамику инвадосом.
- Понимание механизмов деградации матрикса может быть полезным для исследований в области онкологии.
- Дальнейшие исследования могут привести к поиску терапевтических методов борьбы с инвазией опухолей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Понимание процесса формирования инвадосом в физиологически релевантных матриксах имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в исследованиях метастазирования рака. Возможность количественной оценки линейной активности инвадосом на фибриллах коллагена I типа обеспечивает механистический показатель для оценки путей инвазии, стимулируемых внеклеточным матриксом (ВКМ). Это повышает прогностическую достоверность идентификации перспективных соединений-лидеров за счет установления связи между молекулярными мишенями, такими как DDR1, и функциональными фенотипами инвазии в системах, релевантных для данного заболевания.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать DDR1 как рецептор, опосредующий формирование линейных инвадосом на физиологических матриксах коллагена I типа.
- Операционная ценность: предоставляет количественный метод анализа для оценки взаимодействия с мишенью по морфологии инвадосом и деградационной активности.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков, связывая ингибирование рецептора с уменьшением формирования линейных инвадосом в контексте внеклеточного матрикса, релевантного для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Предоставляет стандартизированную смешанную 2D-матрицу (желатин + коллаген I) и 3D-плаг из коллагена I для воспроизводимого формирования инвадосом и оценки инвазии.
- Количественный результат: Позволяет измерять количество линейных инвадосом, их размер и клеточную локализацию с помощью анализа колокализации актина и Tks5 в программе ImageJ.
- Масштабируемость: Совместимость с высокопроизводительной визуализацией и возможность адаптации под многолуночные форматы для проведения кампаний по скринингу соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболевания: Моделирует инвазию опухолевых клеток через физиологический коллаген I типа, который является ключевым барьером при метастазировании.
- Трансляционная преемственность: Связывает механизмы, изученные в 2D, с тестами на 3D-инвазию для оценки влияния соединений на миграцию клеток через фибриллярный коллаген.
- Развитие с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем количественной оценки изменений активности линейных инвадосом как биомаркера потенциала инвазии, зависящего от внеклеточного матрикса.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что особенно актуально для онкологических программ, направленных на изучение метастазирования.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функции рецепторов внеклеточного матрикса (например, DDR1) в регуляции деградации матрикса, зависящей от инвадосом.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых для анализа матриксов со стандартизированными фибриллами коллагена I типа для обеспечения воспроизводимого формирования инвадосом при различных условиях воздействия соединений.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные визуализации (количество и размер линейных инвадосом на клетку), что дает возможность проводить анализ «доза-эффект» и оценивать модуляцию мишени.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярный механизм с фенотипом инвазии в 3D-коллагене I типа, поддерживая доклиническую валидацию антиинвазивных стратегий.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для оценки соединений, модулирующих внеклеточный матрикс, для различных типов рака и стромальных контекстов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в валидации мишени, демонстрируя DDR1-зависимое формирование линейных инвадосом в физиологически релевантных матриксах.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки матрикса и инвариантных протоколов визуализации и количественного анализа.
- Стратегическая ценность: снижает механистическую неопределенность путей инвазии, что позволяет раньше выявлять клинически значимые мишени.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации ингибиторов инвазии с учетом рисков на основе функционального взаимодействия с ECM, а не только биохимической активности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области биологии внеклеточного матрикса, иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии для точного обнаружения инвадосом.
- Результат зависит от контролируемой полимеризации коллагена I и флуоресцентного мечения для сохранения целостности и визуализации фибрилл.
- Необходима стандартизация процедур подготовки матрикса, посева клеток и применения макросов ImageJ между исследовательскими группами для обеспечения сопоставимости данных.
- Адаптация метода для других компонентов внеклеточного матрикса (например, фибронектина, витронектина) может потребовать повторной оптимизации концентраций и времени инкубации.
- Применимо только к типам клеток, формирующим инвадосомы; метод не подходит для неинвазивных моделей или моделей мезенхимальной миграции без актин-зависимых протрузивных структур.
