Оптимизированный протокол для анализа гликолиза и митохондриального дыхания в лимфоцитах

Общая цель данной процедуры заключается в точном измерении гликолиза и митохондриального дыхания в лимфоцитах с помощью анализа внеклеточного потока. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунометаболизма, например, о том, какие метаболические изменения происходят в иммунных клетках при активации, дифференцировке или в ходе заболевания. Основным преимуществом данной методики является возможность эффективного анализа метаболических профилей более 90 образцов одновременно в режиме реального времени.

Хотя этот метод позволяет получить представление о метаболизме лимфоцитов, его также можно применять к другим типам клеток, включая неадгезивные клетки, которые требуют высева в планшет с минимальным нарушением их функциональности. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями, поскольку лимфоциты хрупки и требуют осторожного обращения для сохранения их функциональности и жизнеспособности. За день до проведения эксперимента поднимите картридж с датчиками анализатора внеклеточного потока и заполните каждую лунку вспомогательного планшета 200 µL калибровочного раствора.

Затем опустите картридж на планшет, погрузив датчики в калибровочный раствор, и инкубируйте картридж в инкубаторе при 37 °C без подачи углекислого газа или азота в течение ночи. На следующее утро нанесите в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа по 25 µL адгезивного раствора и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 20 минут. По окончании инкубации удалите адгезив и промойте каждую лунку дважды 200 µL стерильной воды.

Пока планшет высыхает на воздухе, поместите клеточный фильтр с размером пор 70 микрон на коническую пробирку объемом 50 миллилитров и перенесите собранные органы на фильтр. Используя поршень стерильного шприца объемом три миллилитра, протрите ткань через фильтр, поддерживая влажность фильтра и органов на протяжении всего процесса мацерации путем добавления буфера MS по мере необходимости. Затем промойте фильтр от 5 до 10 миллилитров буфера MS, после чего центрифугируйте полученную клеточную суспензию.

Ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах буфера ACK для лизиса эритроцитов. Через пять минут выдержки на льду разбавьте суспензию 10–20 миллилитрами буфера MS и повторно центрифугируйте клетки. По окончании центрифугирования поместите клеточный фильтр с размером пор 30 мкм на коническую пробирку объемом 15 миллилитров и подготовьте фильтр, промыв его одним миллилитром буфера MS.

Ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах свежего буфера MS и профильтруйте клеточную суспензию через сито, чтобы удалить агрегаты лизированных эритроцитов. Добавьте четыре миллилитра свежего буфера MS, чтобы промыть пустую пробирку для лизиса, и пропустите промывочный раствор через сито. Подсчитайте количество клеток и отберите соответствующее количество спленоцитов для анализа внеклеточного потока.

Затем осадите обе группы клеток, ресуспендировав образец спленоцитов для анализа внеклеточного потока в пяти миллилитрах среды RF 10 на льду. Ресуспендируйте клетки для изоляции с помощью магнитных частиц в соответствующих объемах коктейля антител с биотином, антибиотиновых микросфер и буфера MS на указанное время инкубации при температуре от 2 до 8 °C. По окончании второй инкубации соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте осадок в 500 мкл свежего буфера MS на 1 × 10⁸ клеток.

Затем установите подходящую колонку на разделительный магнит и промойте колонку тремя миллилитрами буфера MS, слив прошедшую жидкость. Поместите стерильную коническую пробирку объемом 15 миллилитров под колонку и внесите в колонку весь объем образца клеток. После этого промойте пробирку для инкубации клеток тремя миллилитрами свежего буфера MS, собирая промывочную жидкость в коническую пробирку.

После сбора последней фракции элюата доведите объем в пробирке до 15 миллилитров буфера MS и центрифугируйте негативно изолированные клетки. Затем ресуспендируйте осадок в пяти миллилитрах свежей среды RF 10 на льду. Не позднее чем через три часа после изоляции центрифугируйте все образцы клеток и снова ресуспендируйте осадки в пяти миллилитрах соответствующей среды для анализа перед повторным центрифугированием.

После второго центрифугирования ресуспендируйте осадки до соответствующей экспериментальной концентрации, чтобы получить конечный объем 180 мкл клеток на лунку в свежей среде для анализа, и внесите по 180 мкл клеток в каждую лунку планшета. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 25 минут. Затем центрифугируйте планшет для надежного прикрепления клеток к дну лунок и верните планшет в инкубатор.

Через 30 минут с помощью микропипетки внесите свежеприготовленные исследуемые соединения, подогретые до 37 °C, в соответствующие порты инжектора картриджа сенсора анализатора внеклеточного потока, заполнив контрольные фоновые и неэкспериментальные порты только средой. Верните заполненный картридж в инкубатор и настройте программу анализа внеклеточного потока. Затем установите картридж и запустите программу, заменив калибровочную пластину на аналитическую после завершения калибровки в соответствии с запросом системы.

После проведения анализа внеклеточного потока переходите к измерению содержания белка. Более 90% всех клеточных популяций остаются жизнеспособными, при этом для лимфоцитов наблюдается чистота от 98 до 99%. Конфлюэнтность каждого типа клеток коррелирует с начальной плотностью посева.

Концентрации белков в лизате линейно коррелируют с плотностью посева, что подтверждает возможность использования концентраций белка для точной нормализации данных о внеклеточном потоке. Большее количество клеток коррелирует с более высокой измеренной скоростью потребления кислорода, а также с более выраженным ответом на ингибиторы митохондрий. Более высокая плотность посева приводит к схожим значениям нормализованной скорости потребления кислорода в T-клетках и спленоцитах, в то время как посев 5 × 10⁵ и 1,25 × 10⁵ клеток на лунку приводит к схожим значениям нормализованной скорости потребления кислорода в B-клетках.

Параметры митохондриального дыхания также линейно коррелируют с плотностью посева клеток. Кроме того, низкая утечка протонов указывает на то, что большая часть базового дыхания расходуется на синтез ATP. Более высокая плотность посева приводит к увеличению скорости внеклеточного закисления и более выраженному ответу на воздействие ингибиторов митохондрий.

Параметры гликолиза линейно коррелируют с плотностью посева клеток, при этом высокая плотность посева была определена как наиболее оптимальная для успешного проведения анализа гликолитического стресса. Глюкоза слегка стимулирует митохондриальное дыхание, которое ингибируется олигомицином, в то время как 2-DG не оказывает значительного влияния на потребление кислорода. После освоения данной методики ее выполнение занимает от шести до восьми часов при условии правильного соблюдения протокола.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости содержать клетки на льду до проведения анализа внеклеточного потока, а также точно подсчитать и высеять клетки. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как измерение митохондриального потенциала и поглощения глюкозы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о метаболическом состоянии клеток. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изолировать лимфоциты и проводить анализ внеклеточного потока.