Эффективная и сайта специфических антител к Этикетировочное штаммом раскрученной азида-алкиновая циклоприсоединения

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы ввести химические зонды во фрагмент антитела путем генетического включения аминокислоты, содержащей азид. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химической биологии, такие как модификация белков, инженерия и конъюгация. Основное преимущество этого метода заключается в том, что целевой зонд или бульон могут быть введены в белки или антитела путем простого смешивания.

После создания плазмид добавьте по одному микролитру каждой из 20 микролитров штамма E.Coli DH10-бета в концентрации два раза по 10 к восьми клеткам на микролитр в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. С помощью пипетки аккуратно перемешайте раствор. Затем поместите 20 микролитров смешанного раствора в чистую кювету.

Установите электропоратор на 25 микрофарад и 2,5 киловольта. Затем вставьте кювету в затвор шоковой камеры. Вставьте предметное стекло в камеру до тех пор, пока кювета плотно не соприкоснется с электродами камеры.

Нажмите кнопку импульса один раз, пока электропоризационный аппарат не издаст звуковой сигнал. После этого быстро добавьте в кювету один миллилитр среды SOC. Затем переложите смесь в пробирку.

Выдерживать с встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После завершения инкубации распределите трансформированные клетки E.Coli на агаровые пластины лизогенного бульона, содержащие соответствующие антибиотики. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12 часов.

После завершения инкубации планшетов инокулируйте одну трансформированную колонию в пять миллилитров среды LB, содержащей антибиотики. Выдерживать с встряхиванием в течение 12 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Затем перенесите первичную культуру в 200 миллилитров LB среды со 100 мкг на миллилитр ампициллина и одним миллимолярным AF. Выдерживайте с встряхиванием при температуре 37 градусов Цельсия не менее трех часов.

Добавьте два миллилитра арабинозы 1,6 моляра, когда культура достигнет оптической плотности 0,8 на 550 нанометрах. Затем выдерживать при встряхивании при температуре 30 градусов Цельсия в течение 12 часов. Когда инкубация будет завершена, соберите клетки центрифугированием при 11 000 г в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и заморозьте гранулу при минус 20 градусах Цельсия. Когда клетки будут готовы к лизизу, повторно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах буфера для параплазматического лизиса в свежей центрифужной пробирке. Выдерживайте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем центрифугируйте клеточный лизат при 18 000 умноженных на g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и выбросьте гранулы. Затем добавьте 400 микролитров суспензии смолы Ni-NTA.

С помощью вращателя осторожно взбалтывайте трубку в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. После завершения перемешивания залить суспензию в полипропиленовую колонну. Промойте смолу три раза пятью миллилитрами буфера для промывки.

Разбавьте целевое антитело 300 микролитрами элюирующего буфера. После этого определите концентрацию мутантного белка, как указано в текстовом протоколе. Начните с добавления 10 микролитров 10 микромолярного раствора HerFab-L177AF в фосфатный буфер, содержащий 10 миллимолярных двухосновных фосфатов натрия и 100 миллимолярных хлоридов натрия, в свежую центрифужную пробирку.

Затем добавьте 20 микролитров 200 микромольного раствора Cy 5,5 азадибензоциклооктина в воду. После этого накройте реакционный сосуд алюминиевой фольгой. Дайте реакции, вызванной пятном, протекать в течение шести часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Как только реакция будет завершена, добавьте 30 микролитров образца и 450 микролитров фосфатного буфера для промывки свободного красителя Cy 5,5 в центробежной фильтрующей колонне. Центрифугируйте спиновую колонну при 14 000 умноженных на g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от проточного потока, а затем переложите очищенный образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров

Храните очищенный HerFab с маркировкой при температуре четыре градуса Цельсия, если он не готов к анализу. Начните с добавления 13 микролитров 7,8 микромолярного очищенного HerFab в свежий тюбик. Затем добавьте пять микролитров буфера для образцов белка LDS.

Выдерживайте смесь при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. После инкубации присоедините четырех-12%-ную гелевую кассету Bis-Tris SDS-PAGE к ячейке для электрофореза. Добавляем бегущий буфер.

Затем загрузите образцы конъюгированного белка в предварительно окрашенный генератор молекулярной массы. Проведите гель-электрофорез в течение 35 минут при напряжении 200 вольт. После завершения электрофореза перенесите гель в систему документирования и анализа геля.

Отсканируйте на наличие Cy 5,5, а затем окрасьте гель коммерческим белковым красителем. В этом исследовании фрагмент антитела Her-Fab специфично конъюгирован с Это достигается путем включения в фрагмент аминокислоты, содержащей азид, а затем реакции мутантного фрагмента антитела с напряженным циклооктином. Анализ SDS-PAGE проводится для мутантных белков, экспрессируемых как с азидсодержащей аминокислотой, так и без нее.

Как видно, полноразмерный фрагмент антитела получался только в присутствии аминокислоты. Антитело, содержащее аминокислоту, оценивают на конъюгацию в реакции с Cy 5,5-связанным производным азадибензоциклооктина Cy 5,5 и анализируют с помощью SDS-PAGE. Флуоресцентные изображения показывают конъюгацию фрагмента мутантного антитела с Cy 5,5, в то время как в контроле конъюгация не наблюдалась.

После правильной экспрессии и очистки белка ацетилфенилаланином белок может быть эффективно мечен с помощью зонда со штаммом Поскольку реакция мечения не требует дополнительного реагента, вы можете ввести зонд в целевой белок, просто смешав зонд с белком. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сайт-специфично вводить химический зонд во фрагмент антитела путем генетического включения аминокислоты, содержащей азид.