Хондрогенный Дифференциация Индукционная полученных из жировой ткани стволовых клеток под действием центробежной силы тяжести

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы вызвать хондрогенную дифференцировку ИСС при повреждении хряща. Этот метод заключается в том, чтобы индуцировать прехондрогенную дифференцировку ИСС с помощью центробежной силы тяжести. Хотя этот метод может дать представление о хондрогенной дифференцировке ИСС, он также может быть применен к другим системам, таким как остеогенная и фиброгенная дифференцировка.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что хондрогенная дифференцировка может быть легко индуцирована из стволовых клеток без лечения цитокинов. Демонстрировать процедуру будут Йери Элис Рим и Юджун Нам из моей лаборатории. Начните с сбора 80% стволовых клеток, полученных из жировой ткани, из чашки для культуры объемом 100 миллилитров, выбросив среду и промыв пятью миллилитрами PBS.

Затем добавьте один миллилитр PBS, содержащий один миллимоляр ЭДТА, и инкубируйте в течение двух минут при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% углекислого газа. Через две минуты осторожно постучите по планшету для культивирования, затем добавьте четыре миллилитра свежей среды и переложите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте ячейки при 250-кратном g в течение двух минут при комнатной температуре.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу. Затем повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах среды. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Для центробежной гравитационной нагрузки переложите в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров в 2,5 раза от десяти до пятой ячейки и центрифугируйте при 2400 умноженных на g в течение 15 минут. После центрифугирования приступайте либо к выращиванию гранул, либо к культивированию микромассы. Сразу после центрифугирования аспирируют надосадочную жидкость и по 500 микролитров хондрогенной дифференцировочной среды, или ХДМ, и 50 мкг на миллилитр свежеприготовленного L-аскорбиновой кислоты-2-фосфата в гранулу.

Положительный контроль, индуцируют хондрогенную дифференцировку и собирают его клетки путем добавления CDM, содержащего 10 нанограмм на миллилитр TGF-beta-1. Неплотно закройте пробирки крышками и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% углекислого газа, в течение трех недель. Сразу после центрифугирования с гравитационной нагрузкой аспирировать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулу в 10 микролитрах CDM.

Чтобы сформировать микромассу, пипеткой поместите повторно взвешенные клетки в центр лунки 24-луночного планшета, а затем поместите планшет в инкубатор. Через два часа осторожно добавьте в лунку 500 микролитров CDM, пипетируя у стенки пластины, чтобы избежать нарушения микромассы. В качестве положительного контроля проведите культивирование микромассы с нецентрифугированными клетками путем добавления CDM, содержащего 10 нанограммов на миллилитр TGF-beta-1.

Инкубируйте микромассу в течение трех недель. На 21-й день после формирования микромассы с помощью пипетки соберите гранулы сфероида, а затем промойте 1X PBS. Закрепите сфероидальные гранулы погружением в 4% параформальдегид на 24 часа.

На следующий день выбросьте фиксатор и промойте гранулы клеток деионизированной водой. Поместите один слой марли на тканевую кассету и перенесите неподвижные сфероидные гранулы с помощью пипетки. Накройте гранулу, сложив марлю, и закройте кассетную крышку.

Затем обезвоживайте сфероидные гранулы, погрузив их в 70% этанол на пять минут при комнатной температуре. Затем продолжайте использовать серию концентраций этанола в течение пяти минут каждая. Затем погрузите гранулы в 100% ксилол на 15 минут.

Погрузите шарики сфероида в парафин при температуре 56 градусов Цельсия для заделки. Затем вырежьте срезы толщиной пять микрон из залитой парафином клеточной гранулы с помощью вращающегося микротома. Всплыть секции в 50% этаноле, а затем перенести их на водяную баню при температуре 50 градусов Цельсия.

Установите плавающие секции на предметные стекла, а затем приступайте к сафранину о и альцианскому синему для иммунофлуоресцентного окрашивания. Чтобы определить подходящую центробежную гравитационную силу, ASC вращали при центробежной гравитации 0, 300, 600, 1, 200 и 2, 400 раз g в течение пятнадцати минут. Экспрессию мРНК SOX9 оценивали через 24 часа после стимуляции компьютерной графикой.

CG в 2,400 раза больше g значительно индуцировала экспрессию мРНК SOX9. Для оценки экспрессии генов, связанных с хондрогенезом, общую РНК извлекали из нестимулированных ИСС, ИСС, которые были центрифугированы или обработаны TGF-бета-оном. Как видно на рисунке, стимуляция компьютерной графики индуцирует экспрессию коллагена 2-го типа и аггреканов.

Чрезмерная экспрессия коллагена 2-го типа у пациентов с САС, получавших КГ, была подтверждена иммунофлуоресценцией с использованием антитела против коллагена 2-го типа в конъюгированном вторичном антителе Alexa Fluor 594. Для определения влияния КГ на связанную с хондрогенезом сверхэкспрессию ЭКМ, ИСС лечили TGF-бета-он в качестве положительного контроля. Отрицательный контроль представлял собой культуру гранул, не подвергавшуюся нагрузке CG или обработке TGF-бета-один.

Сверхэкспрессию ВКМ, связанной с хондрогенезом, оценивали в сфероидных гранулах, состоящих из центрифугированных АСК с использованием сафранина О и окрашивания алцианским синим. Гликозаминогликан, основной компонент суставного хряща, окрашивался в синий цвет альцианским синим или окрашивался в оранжевый цвет сафранином о. После 14 дней культивирования микромассы конденсацию хондроцитов оценивали по размеру агрегатов.

Размер каждого агрегата, сгенерированного компьютерной графикой, составлял около 0,5 миллиметра. После освоения эту технику можно сделать за 30 минут, если ее правильно выполнить. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как индуцировать хондогенную дифференцировку стволовых клеток с помощью центробежной силы тяжести.