Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

Общая цель этого протокола заключается в разработке искусственных факторов сплайсинга, которые могут специфически манипулировать альтернативным сплайсингом данной мишени. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области процессинга РНК, такие как регуляция и неправильная регуляция альтернативного сплайсинга в раковых клетках. Главным преимуществом данной методики является ее гибкость.

Мы можем создать искусственные факторы, которые либо стимулируют, либо ингибируют различные типы альтернативного сплайсинга в любом конкретном гене. Эту процедуру будут демонстрировать Хуань-Хуань, научный сотрудник моей лаборатории, и Цяньюнь, постдок в моей лаборатории. PUF DNA дикого типа используется в качестве шаблона для генерации кастомизированного скаффолда домена PUF.

Используйте ПЦР-праймеры, содержащие последовательности PUF, которые специфически распознают разные нуклеотиды РНК в каждой позиции. Для каждого повтора PUF используйте четыре разных праймера, чтобы распознать разное основание в каждой позиции. В первом раунде ПЦР используйте показанные пары праймеров для создания кодирующих последовательностей для четырех ППУ-повторов, фрагментов универсального моста и фрагментов колпачков.

Во втором раунде используйте продукты ПЦР, полученные на последнем этапе, в качестве шаблонов с показанными комбинациями праймеров для создания кодирующих последовательностей для кодов распознавания РНК от R-one до R-four и от R-five до R-eight. В третьем раунде используйте продукты из второго раунда и моста с четвертого по пятый в качестве шаблонов с прямым праймером R-one и обратным праймером R-eight для создания кодирующих последовательностей для R-one до R-eight без колпачков. В четвертом раунде ПЦР используйте R-1 до R-восемь, пятипростую торцевую крышку и трехпростую торцевую крышку в качестве шаблонов для создания кодирующих последовательностей для полных доменов PUF.

Чтобы начать трансфекцию клеток HEK-293T, смешайте липосомальный реагент для трансфекции, осторожно перевернув флаконы. Затем разведите два микролитра липосомального реагента для трансфекции в 50 микролитрах восстановленной сывороточной среды на одну трансфекцию. Аккуратно перемешайте, а затем выдержите в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем разведите 04 мкг богатого глицином вектора экспрессии домена и 0,2 мкг репортерной плазмиды модульного сплайсинга в 50 микролитрах восстановленной сывороточной среды в стерильной пробирке. Затем разведите 0,4 мкг вектора экспрессии RS-эффекторного домена и 0,2 мкг PGZ-трехрепортерной плазмиды в 50 мкм восстановленной сывороточной среды. Наконец, разведите 0,4 мкг вектора экспрессии PGL-RS-PUF и 0,2 мкг репортерных плазмид PEZ-1B или PEZ-2F в 50 микролитрах восстановленной сывороточной среды в стерильной пробирке.

После пятиминутной инкубации при комнатной температуре аккуратно перемешайте разведенный липосомальный реагент для трансфекции с разведенными плазмидными смесями. Конечные смеси инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте смеси для трансфекции, содержащие векторы экспрессии, в каждую лунку 24-луночного планшета, засеянного клетками HEK-293, и инкубируйте в течение не менее 12 часов в увлажненном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После 12 часов инкубации соберите трансфицированные клетки с помощью трипсинизации и центрифугирования. После центрифугирования выбросьте среду и добавьте 0,5 миллилитра буфера для экстракции РНК на пробирку. Добавьте 0,1 миллилитра хлороформа на 0,5 миллилитра буфера для экстракции РНК в каждый образец.

После инкубации центрифугируйте пробирки в течение 15 минут при температуре 12 000 G и четырех градусах Цельсия. Затем переложите водную основу в свежую трубку. Добавьте 0,25 мл изопропанола на 0,5 мл буфера для экстракции РНК, используемого при начальной гомогенизации.

Перемешайте вортексом, и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугирования, как и раньше, осадок РНК обычно виден на дне пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу РНК 0,5 мл 75% этанола на 0,5 мл буфера для экстракции РНК.

Энергично вдохните, а затем центрифугируйте при 7,500 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После отжима удалите надосадочную жидкость и высушите гранулы РНК на воздухе. Растворите РНК в 50 микролитрах воды, не содержащей РНКазы.

Затем добавьте два микролитра по пять единиц на микролитр ДНКазы-один, семь микролитров 10-кратного буфера и 11 микролитров воды на каждый 50-микролитровый раствор РНК. После инкубации нагрейте растворы до 70 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы инактивировать ДНКазу. После проведения реакции обратной транскриптазы для синтеза кДНК из каждого образца добавьте компоненты меченой организмом ПЦР-реакции в порядке, показанном на экране, в пробирки для ПЦР.

Приготовьте одну реакцию на образец. Запустите программу ОТ-ПЦР на термоамплификаторе. Наконец, растворите продукты ПЦР с помощью электрофореза с помощью 10% полиакриламидного геля с буфером TBE.

Используйте флуоресцентный сканер для визуализации продуктов и измерьте количество каждой сплайсированной изоформы с помощью программного обеспечения для денситометрии. Для иммунофлуоресцентного анализа для измерения апоптоза приготовьте трансфекционную смесь, содержащую богатые глицином плазмиды экспрессии доменов, как было показано ранее, и трансфектируйте клетки HeLa, выращенные на покрытых полилизином стеклянных покровных пластинах в шестилуночной пластине. Через 24 часа после трансфекции зафиксируйте клетки на покровных стеклах одним миллилитром 4%-ного параформальдегида в 1х ПБС в течение 20 минут при комнатной температуре.

Затем аккуратно промойте ячейки на покровных листках двумя миллилитрами 1х ПБС в течение пяти минут. Затем проникните в клетки 0,2% Triton X-100 в 1x PBS в течение 10 минут. После трехкратного промывания 1x PBS, как и раньше, блокируйте неспецифическое связывание 3%-ным бычьим сывороточным альбумином в 1x PBS в течение 10 минут.

Разведите антитело к флагу от одного до 1000 в 3% BSA в PBS и пипетируйте 30 микролитров разведенного антитела к флагу на листе парапленки. С помощью щипцов удалите покровную планку. Тщательно вытрите излишки буфера лабораторными салфетками, а затем положите защитный слой ячейкой вниз на раствор против флага.

Выдерживать в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации добавьте примерно 500 микролитров 1x PBS на клеточную сторону защитного стекла, пока он не всплывет на поверхности раствора. Верните его в шестилуночный планшет с 1x PBS в лунках.

Инкубировать с вторичными антителами на парапленке, как и раньше, в течение 15 минут. Вымойте как и раньше, а затем закрепите защитные стекла на предметных стеклах микроскопа с помощью монтажной среды, содержащей DAPI. Визуализируйте клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, а сфотографируйте их с помощью цифровой камеры.

С помощью иммунофлуоресцентной микроскопии многие клетки, экспрессирующие Gly-PUF-531, имели фрагментированную ядерную ДНК, что указывает на то, что они подвергались апоптозу. В качестве контроля, клетки, экспрессирующие Gly-PUF дикого типа, имели менее фрагментированную ядерную ДНК по сравнению с трансфицированными клетками Gly-PUF-531. Здесь иммунофлуоресцентная микроскопия с использованием антитела против флага, объединенного с DAPI-окрашенными клетками, показывает, что Gly-PUF-531 локализован преимущественно в ядрах трансфицированных клеток.

Gly-PUF дикого типа также локализовался в ядрах трансфицированных клеток, что позволяет предположить, что эти ESF диссоциируют от своих мишеней, когда полностью сплайсированные мРНК транспортируются в цитоплазму. Процент апоптотических клеток с фрагментированной ядерной ДНК измеряли по случайно выбранным полям изображений флуоресцентной микроскопии. После освоения конструирование ППУ-скаффолдов со специфичностью связывания РНК может быть выполнено за два дня, если оно выполнено правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конкретно манипулировать альтернативным сплайсингом в клетках человека путем создания искусственных факторов.