Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий In Vitro

Общая цель этой методики заключается в захвате липидно-проксимальных белок-белковых взаимодействий in vitro. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области митохондриальной динамики, например, как вспомогательные липиды могут влиять на белок-белковые взаимодействия на внешней мембране митохондрий. Основное преимущество этого метода заключается в том, что привязка растворимых белковых доменов к липидным матрицам обеспечивает возможность получения более нативного подтверждения.

Кроме того, сложные взаимодействия между растворимыми белками и их связанными партнерами могут быть оценены в присутствии определенных липидных кофакторов. Хотя мы используем этот метод для исследования белковых взаимодействий в механизме деления митохондрий, он также может быть применен к другим белковым комплексам, которые локализуются в различных мембранных компартментах. Демонстрировать эту процедуру будет Райан, аспирант из моей лаборатории.

Сначала соедините растворы хлороформа нужных липидов в чистой стеклянной пробирке. Испаряйте растворитель сухим газообразным азотом, вращая трубку, чтобы образовалась тонкая липидная пленка. Затем удалите остатки растворителя с помощью центробежного испарителя в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого добавьте предварительно нагретый буфер А, чтобы получить конечную концентрацию липидов от одного до двух миллимоляров. Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия с периодическим вортексированием для полной ресуспендирования липидной смеси. После инкубации переложите липидную смесь в пластиковую пробирку и поместите пробирку в жидкий азот примерно на 30 секунд до полного замерзания.

Затем поместите трубку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на одну-две минуты до полного оттаивания. Затем подготовьте липидный экструдер, замочив четыре фильтрующие опоры и поликарбонатный фильтр в буфере А и собрав экструдер в соответствии с инструкциями производителя. Выдавите липидный раствор через фильтр 21 раз, используя мягкое постоянное давление, чтобы обеспечить равномерное распределение по размерам.

Во время экструзии используйте медленное постоянное давление, чтобы обеспечить однородность размера липосом. С фильтром в один микрон это менее важно. Но с меньшими размерами фильтров может быть введена более кажущаяся неоднородность.

Храните экструдированные липосомы при температуре четыре градуса Цельсия. Инкубируйте меченный His-меченным митохондриальный фактор деления или Mff со скаффолдными липосомами в течение не менее 15 минут при комнатной температуре в буфере А и ВМЭ. Для контроля без Mff инкубируйте липосомы с меченным His-меткой контрольным белком, таким как GFP, чтобы связывать и экранировать подвергшийся воздействию никель-NTA.

Добавьте в смесь липосом, связанный с динамином белок one или Drp1, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Далее переложите пять микролитров образца на лист лабораторной пленки и уложите поверх образца медно-родиевую сетку с углеродным покрытием. После инкубации в течение одной минуты удалите лишнюю жидкость фильтровальной бумагой и добавьте каплю 2%-ного уранилацетата.

После инкубации еще минуту удалите лишнее пятно фильтровальной бумагой, и переложите образец в сетчатый ящик. На следующий день визуализируйте образцы с помощью просвечивающего электронного микроскопа с увеличением от 18 500 до 30 000 раз, чтобы наблюдать за ультраструктурными изменениями морфологии белков и липосом. Инкубируйте меченные His-мечками Mff и Fis1 с липосомами каркаса в течение 15 минут при комнатной температуре в буфере А и BME.

Добавьте Drp1 и выдержите каждую смесь еще 15 минут при комнатной температуре. Перенесите трубки в амплификатор, установленный на 37 градусов Цельсия, и запустите реакцию, добавив ГТФ и хлорид магния. В нужные моменты времени перенесите по 20 микролитров каждой реакционной смеси в лунки микротитровальной пластины, содержащей пять микролитров 0,5 молярной ЭДТА, чтобы хелатировать магний и остановить реакцию.

После этого подготовьте набор стандартов фосфатов, разбавив фосфат калия в буфере А и BME для калибровки результатов. Добавьте по 20 микролитров каждого стандарта в лунки, содержащие пять микролитров 0,5 моляра ЭДТА. Добавьте в каждую лунку по 150 микролитров реактива малахитового зеленого цвета.

Наконец, прочитайте OD 650 через пять минут после каждого сложения. ГТФ будет медленно гидролизоваться в присутствии кислого малахитового зеленого реагента. Таким образом, этот реагент следует добавлять во все лунки для образцов в течение 10 минут после измерения поглощения, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум.

В отсутствие Drp1 ни Mff, ни GFP не приводили к деформации мембраны. И только безликие липосомы наблюдались для GFP-украшенных обогащенных скаффолдных липосом, или ESL. Однако, когда Drp1 был добавлен в шаблоны ESL, украшенные Mff, ремоделирование липосом стало очевидным.

Украшение SL с помощью Mff с улучшенной активностью GTPase. И наоборот, когда подверженные воздействию NTA группы голов блокировались с помощью GFP, помеченной His, эта усиленная активность ГТФазы была устранена. Связывание Fis1, не имеющего трансмембранного домена, с SL, также не привело к стимуляции активности ГТФазы Drp1.

Как и в случае с SL, добавление SL/Cl к Drp1 приводило к небольшой стимуляции активности ГТФазы, которая обращалась вспять путем связывания His-меченного Fis1 или GFP к липосомам. Наблюдался синергизм между Mff и кардиолипином, поскольку активность ГТФазы Drp1 стимулировалась в 2,6 раза при его инкубации с SL/CL, украшенным Mff. Когда шаблоны SL/PE/CL были дополнены Mff, активность Drp1 была усилена.

Способность Drp1 ремоделировать липосомы в липидные канальцы была усилена за счет добавления ПЭ к липосомам каркаса. После освоения эти каркасы могут быть подготовлены и использованы в течение нескольких часов, если процедура выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы взаимодействия белков и липидов, такие как седиментация и анализ светорассеяния, чтобы охарактеризовать функциональные взаимодействия.

Применение этого метода позволяет людям, изучающим транслокацию белка в определенную биологическую мембрану, исследовать переходные белковые взаимодействия и влияние специфических липидных кофакторов на формирование и стабилизацию основных клеточных сборок.