3D цельнозерновой сердца Инфаркт Анализ тканей

Рассказчик}Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы облегчить структурированный и воспроизводимый метод 3D-обработки тканей всего сердца, который может быть использован для оценки точности нацеливания интрамиокардиальных инъекций в пограничную зону инфаркта. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кардиорегенеративной медицины, такие как развитие практики и оптимизация инъекционных методик. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она предлагает стандартизированный и воспроизводимый метод 3D-обработки тканей всего сердца.

Применение этого метода распространяется на разработку кардиорегенеративной терапии и проверку точности инъекций обычных методов доставки. Целью данной терапии стволовыми клетками сердца является введение клеток в пограничную зону инфаркта для стимуляции местного васкулогенеза и защиты кардиомиоцитов. Захват сердца в конечной диастолической фазе требует практики и терпения.

Визуальная демонстрация этих шагов имеет решающее значение. Начните с отделения перикарда от микрогранул сердца, в которое вводится микрогранула, сохраняя предсердия и желудочки в целости и сохранности. Когда вся ткань будет удалена, с помощью ножниц Клинкенберга рассеките восходящую аорту примерно на один сантиметр выше аортального клапана и разрежьте нижнюю вантовую и легочную вены примерно на расстоянии одного сантиметра от предсердия.

После фиксации верхушки сердца на дне пластикового закладного контейнера для предотвращения флотации наложите 2-0 швов через оставшуюся часть аорты к краям контейнера и зафиксируйте сердце. Следите за тем, чтобы сердце было по центру и не касалось стенок емкости. Когда орган будет закреплен в конце диастолической геометрии, используйте противомоскитные зажимы, чтобы захватить нижнюю кавальную вену, и с помощью 50-миллилитрового шприца медленно вводите свежеприготовленный агар 50-60 градусов Цельсия в правое предсердие через верхнюю кавальную вену до тех пор, пока правое предсердие и желудочек не будут полностью заполнены.

Чтобы получить встроенное сердце, максимально напоминающее конечную диастолическую геометрию, зафиксируйте верхушку левого желудочка ко дну емкости и заполните правый желудочек агаром при этом легочные вены зажаты. Далее наложите на легочные вены противомоскитный зажим и аккуратно пропустите через аортальные клапаны новый наполненный агаром 50 миллилитровый шприц в ретроградном направлении. Медленно вводите раствор в левый желудочек до полного заполнения желудочка и левого предсердия, зажимая аорту после того, как левый желудочек будет заполнен

Теперь налейте оставшийся агар в контейнер до тех пор, пока сердце не будет полностью покрыто, и поместите две жесткие пластиковые трубки внутрь контейнера, которые будут служить опорными структурами во время регистрации изображения. Затем поместите сердце при температуре от двух до семи градусов Цельсия не менее чем на четыре часа, чтобы агар затвердел. После магнитно-резонансной томографии переверните контейнер вверх дном и дайте воздуху между агаром и стенками контейнера удалить твердый раствор агара и сердце из контейнера.

Снимите пластиковые стержни. Затем с помощью мясорезки разрезайте агаровый блок и сердце на пятимиллиметровые ломтики от верхушки до основания сердца, разрезая параллельно нижней части агарового блока, чтобы угол наклона ломтиков оставался таким же, как на полученных магнитно-резонансных изображениях. Когда все срезы будут получены, окрасьте образцы тканей в TTC.

Через 15 минут сфотографируйте срезы с обеих сторон под перпендикулярным углом, затем тщательно промойте срезы в 0,9%-ном физиологическом растворе. Чтобы получить изображение образцов с помощью флуоресцентной микроскопии, выберите флуоресцентный режим визуализации на сканере с переменным режимом и установите размер пикселя 100 на 100 микрон. Для первого блока фильтров выберите полосовой фильтр, который перекрывается с длиной волны излучения флуоресценции шарика в первом канале, затем для полосового фильтра для второго фильтрующего блока за пределами длины волны излучения во втором канале.

Затем выберите подходящий блок фильтров, установите фотоумножитель на соответствующее напряжение, а возбуждающий лазер — на длину волны возбуждения, ближайшую к длине волны вводимых микрошариков. После того, как все изображения были получены, в соответствующем программном обеспечении для постобработки сегментируйте миокард и эндо- и эпикардиальные границы левого желудочка на магнитно-резонансных изображениях с последующей аналогичной сегментацией миокарда и мест инъекции на флуоресцентных изображениях. Затем линейно интерполируйте зарегистрированные сегменты изображения с обеих сторон срезов, чтобы восстановить исходную толщину образца и создать 3D-модель данных.

С сердцем, закрепленным на конце диастолической геометрии, как только что было продемонстрировано, в этом репрезентативном эксперименте агар успешно прилегал к сердечной ткани, что позволило разрезать ткань под нужным углом с одинаковой толщиной среза. Как на 2D-флуоресцентных, так и на магнитно-резонансных изображениях места шрама и инъекции четко различимы. Окрашенные ткани TTC и магнитно-резонансные изображения с поздним усилением гадолинием обеспечивают контроль для оценки рубцов при флуоресцентной визуализации.

Постобработка позволяет реконструировать 3D-геометрию сердца ex vivo на основе сегментации и флуоресцентных изображений, что позволяет оценить точность 3D-инъекции. В данном исследовании инъекционные отложения и пограничная зона инфаркта были защищены на стенке эндокарда, а также измерены расстояния между проекциями на поверхности эндокарда. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как хирургическая оценка, количественная оценка размера инфаркта или валидация других трехмерных методов визуализации.

Мы использовали эту методику для оценки точности введения в пограничную зону инфаркта. Данное исследование проводилось с целью совершенствования кардиорегенеративной терапии сердечной недостаточности. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить сердце, как встраивать и обрабатывать сердечную ткань, а также как выполнять флуоресцентную визуализацию образцов сердечной ткани.