Исследования в взаимодействий аминокислот и пептидов с использованием неорганических материалов с использованием одномолекулярной силовой микроскопии

Общая цель метода одномолекулярной силовой спектроскопии заключается в определении силы адгезии и характера взаимодействий между аминокислотами или пептидами с различными поверхностями. Этот материал может помочь ответить на ключевые вопросы в области химии поверхности и быть использован для разработки новых композитов и хордовых. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она предоставляет информацию о взаимодействии между нужной молекулой и поверхностями на уровне одной молекулы.

Для начала приобретите консоли AFM из нитрида кремния, оснащенные силиконовыми наконечниками с номинальным радиусом кантилевера в два нанометра. Установите наконечник на держатель. Очистите каждую из консолей AFM, опустив их в этанол на 20 минут, а затем высушите при комнатной температуре.

Затем поместите наконечники в плазменную камеру и обработайте консоли, подвергнув их воздействию кислородной плазмы в течение пяти минут. Приготовьте раствор, содержащий 15 частей метилтриэтоксисилана и одну часть трех аминопропилтриэтоксисиланов, и подвесьте канитлеверы на высоте трех сантиметров над раствором, находясь в инертной атмосфере. Важно, чтобы наконечники и держатель не касались силановой смеси.

Кроме того, силан очень чувствителен к влаге, а потому эти наконечники нужно проводить в инертной атмосфере. После запечатывания подключите эксикатор к вакуумному насосу и подайте вакуум на два часа, чтобы сформировать монослой из двух типов смешанных силановых соединений на поверхности консолей. Аккуратно снимите кончики и положите их на горячую плиту, разогретую до 70 градусов Цельсия.

Оставьте кончики сохнуть на 10 минут. Охладите наконечники при комнатной температуре, прежде чем погрузить их в раствор Fmoc-PEG-NHS на один час при комнатной температуре. Затем опустите кончики в хлороформ на пять минут, а затем в ДМФА еще на пять минут.

После инкубации в ДМФА снимите защиту с Fmoc-групп прикрепленных молекул ПЭГ, погрузив кончики в 20% раствор пиперидина в ДМФА на 30 минут. Снова окуните кончики в ДМФА на четыре минуты, а затем в N-метил-2-пирролидон еще на четыре минуты. Чтобы соединить аминокислоты с наконечниками, погрузите их на полтора часа в раствор для соединения аминокислот общей концентрацией 30 миллимоляров и пять миллилитров N-метил-2-пирролидона.

Для защиты оставшихся свободных или нереакционноспособных остатков ПЭГ по ацетильной группе окуните наконечники на 30 минут в молярную смесь 0,65 из четырех частей уксусного ангидрида и одной части диизопропилэтиламина и N-метил-2-пирролидона. Затем последовательно окуните пептидные аминокислотные функциональные наконечники на четыре минуты в NMP, хлороформ, 50% этанол и воду, прежде чем окончательно высушить наконечник на воздухе. Прикрепите желаемую испытательную поверхность к металлическому держателю АСМ с помощью имеющейся в продаже эпоксидной смолы.

Затем поместите металлический держатель в стеклянный держатель АСМ, который имеет форму небольшой чашки Петри. Наполните подстаканник буфером TRIS. А затем поместите металлический держатель на столик AFM ниже держателя наконечника.

Затем установите наконечник АСМ на оптическое стекло АСМ. Поместите блок оптического стекла в головку АСМ. И поставить голову АСМ на сцену.

Затем откалибруйте кантилеверы AFM с постоянными пружин в диапазоне от 10 до 30 пиконутонов на нанометр. Типичное измерение силы приводит к получению кривой расстояния силы, подобной показанной здесь. Первый взгляд указывает на неспецифические взаимодействия между зондом и поверхностью, а второй — на конкретное событие адгезии.

Из нескольких сотен кривых силового расстояния можно построить гистограмму, построив график зависимости количества событий адгезии от силы. Применение гауссова аппроксимации к этим гистограммам определит наиболее вероятную силу. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как химически модифицировать наконечники АСМ аминокислотами или пептидами и как проводить одномолекулярную силовую спектроскопию с помощью АСМ.