Разведению и двухцепочечную РНК-опосредованный нокдаун гена в Скрыть Beetle, Кожеед пятнистый

Общая цель этой процедуры заключается в изучении функции генов в Dermestes maculatus, новой модельной системе насекомых, которая представляет разнообразную кладу жуков и облегчает изучение фундаментальных и прикладных исследовательских вопросов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, эволюционной биологии и за ее пределами, позволяя проверить функцию генов у эмбрионов и взрослых особей Dermestes. Основное преимущество этого метода заключается в том, что РНК-интерференция может быть использована для нацеливания на любой ген, основываясь только на информации о последовательности, даже при отсутствии полной последовательности генома.

Представленные здесь методы не только обеспечивают подход к изучению функции генов у Dermestes. Они также могут быть применены для разработки новых модельных систем насекомых и, возможно, для борьбы с насекомыми-вредителями. Чтобы подготовить клетку для выращивания D.maculatus, сначала разложите тонкий слой древесной стружки в клетке для насекомых среднего размера.

Поместите участок пенополистирола в клетку, чтобы у личинок была среда для окукливания. Добавьте в клетку от двадцати до пятидесяти взрослых жуков или личинок позднего возраста. Положите влажный корм для кошек в чашку Петри или весовую лодку в качестве источника пищи.

Накройте клетку сетчатой тканью и поместите ее в инкубатор. Прежде чем начать сбор эмбрионов, сначала тщательно проверьте клетку на наличие эмбрионов и удалите их. Как только клетка станет чистой, поместите в клетку растянутый ватный тампон и инкубируйте колонию при температуре 30 градусов по Цельсию.

По истечении соответствующего временного окна соберите ватный тампон, удалите всех присутствующих взрослых особей и поместите их обратно в клетку. На листе черной строительной бумаги аккуратно сожмите ватный тампон и медленно разорвите его на тонкую нить, чтобы все присутствующие яйца упали на черную бумагу. Возьмите стандартную крышку для чашки Петри, и с помощью листа черной фильтровальной бумаги накройте внутреннюю часть.

Приклейте кусок двустороннего скотча по краю стандартного предметного стекла микроскопа. Поместите предметное стекло микроскопа на черную фильтровальную бумагу в крышке чашки Петри. Взяв бумагу, содержащую собранные эмбрионы, легкими постукивающими движениями переложите зародыши в крышку чашки Петри.

С помощью кисти выровняйте эмбрионы на ленте перпендикулярно предметному стеклу, передним или задним концом по направлению к краю. Чтобы начать работу с РНК-интерференцией, сначала наберите 2-4 микролитра дцРНК в наконечник для микрозагрузчика объемом 20 микролитров. Вставьте наконечник в предварительно вытянутый стеклянный капилляр, называемый иглой, и аккуратно введите раствор пипеткой в иглу.

Закрепите иглу в стеклянном капиллярном держателе, а затем соберите капиллярный держатель в микроманипулятор. Далее аккуратно перенесите предметное стекло с прикрепленными эмбрионами на предметный столик препарирующего микроскопа. Переместите предметное стекло, чтобы переместить один эмбрион в центр поля, и сфокусируйте микроскоп.

Глядя в область рассечения, расположите кончик капилляра с помощью микроманипулятора. Поднесите кончик ближе к концу первого зародыша в ряду. Включите подачу азота или воздуха, а затем установите переключатель входного сигнала соленоида в положение «Вакуум».

Отрегулируйте регулятор давления выброса на 10-15 фунтов на квадратный дюйм, в зависимости от устройства. Откройте капилляр, и цветной раствор дцРНК заполнит наконечник, готовый к инъекции. Переместите кончик капилляра вперед и аккуратно проколите эмбрион.

При идеальных настройках давления эмбриональная жидкость не будет поступать в капилляр. Нажмите на ножной переключатель, чтобы выбросить дцРНК в эмбрион до тех пор, пока не будет выдано соответствующее количество. Оставьте кончик внутри эмбриона примерно на две секунды, а затем осторожно извлеките его.

После того, как все эмбрионы будут введены, поместите предметное стекло в чашку Петри. Добавьте в форму влажный ватный тампон, стараясь не допустить его соприкосновения с горкой. Накройте чашку Петри крышкой и оберните ее герметизирующей пленкой.

Пометьте его типом дцРНК, концентрацией, датой, временем и количеством введенных эмбрионов. Наконец, поместите чашку в инкубатор при температуре 30 градусов Цельсия до тех пор, пока эмбрионы не вылупятся. Чтобы выполнить пРНК-интерференцию, сначала соберите куколок из колонии.

Отсортируйте куколок мужского и женского пола в две отдельные чашки и поместите их в инкубатор с температурой 30 градусов Цельсия. Ежедневно проверяйте тарелки на наличие закрытых жуков и переносите этих особей в две отдельные чашки Петри для взрослых особей мужского и женского пола. Кормите этих взрослых особей и поддерживайте пластины через день, пока не выкроется достаточное количество взрослых особей, чтобы начать инъекции.

Как только взрослая лужа будет заполнена, обезболите самку жука и держите отдельную брюшную сторону вверх одной рукой, держа шприц в другой. Аккуратно проникните в сегмакорию мембраной между стернитами 2 и 3. Проверьте шкалу шприца и медленно выдайте около двух микролитров на одну женщину.

После инъекции удерживайте иглу неподвижно не менее 5 секунд, а затем осторожно извлеките ее. Пересадите инъекционных самок в чашку Петри с кошачьим кормом. Подпишите блюдо соответствующим образом.

Поместите блюдо в инкубатор с температурой 30 градусов Цельсия. Через 24 часа перенесите инъекционных самок в мини-клетку и добавьте равное количество неинъекционных молодых самцов. Пометьте клетку и добавьте корм для кошек.

Поместите клетку в инкубатор с температурой 30 градусов по Цельсию, чтобы обеспечить спаривание. Полученное потомство затем может быть исследовано для определения эффектов пРНК. На этом изображении показано потомство индивидуума пРНК-интерференции, которому в качестве контроля был введен зеленый флуоресцентный белок DS GFP.

Здесь, как и у особей дикого типа, потомство вылупляется с одной пигментированной полосой на сегмент. Соседние пигментированные полосы были отделены непигментированным промежутком. После парных пРНК-интерференций у пораженного потомства вылуплялись сросшиеся соседние пигментные полосы, указывающие на дефектные сегментарные границы.

Фенотипическая тяжесть была вариабельной, но слияния постоянно появлялись в определенных пограничных областях, что указывает на дефекты, похожие на правило пар. Аналогичным образом, фенотипы кутикулы невылупившихся эмбрионов после парного нокдауна показали потерю брюшных сегментов, а также укорочение длины тела. Окрашивание ранних эмбрионов антителами для изучения молекулярных дефектов показало полосы экспрессии одинаковой интенсивности в каждом сегменте у контрольных особей.

Напротив, сниженная экспрессия была обнаружена в чередующихся полосах у потомства самок, которым вводили Dmac парные дцРНК. Этот паттерн сниженной экспрессии согласуется с дефектным рисунком кутикулы, наблюдаемым у пораженных вылупившихся личинок. Здесь мы впервые представляем наш протокол подавления интересующего гена на ранних стадиях эмбрионального развития у Dermestes maculatus с помощью РНК-интерференции.

Пытаясь выполнить эти процедуры, важно помнить о необходимости использования эмбрионов или взрослых особей женского пола на соответствующей стадии. После освоения в течение получаса можно ввести около 100 эмбрионов или 10 взрослых женщин. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание эмбрионов или количественная ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы о механизмах регуляции генов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать лабораторную колонию Dermestes и выполнить как эмбриональную, так и родительскую РНК-интерференцию у этого жука. В настоящее время для функциональных исследований доступно лишь небольшое количество моделей насекомых. Представленные здесь методы прокладывают путь исследователям к использованию Dermestes в качестве модельной системы, расширяя круг насекомых, поддающихся молекулярно-генетическому анализу.