Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression

Общая цель этой процедуры заключается в надежной идентификации живых дофаминергических нейронов в культурах среднего мозга с использованием экспрессии eGFP, вызванной тирозингидрокслазой, сбора одиночных клеток и генерации библиотеки секвенирования РНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области болезни Паркинсона и наркомании, поскольку он позволяет проводить экспрессию генов и электрофизиологические анализы на идентифицированных живых дофаминергических нейронах в культуре. Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает средства для надежной идентификации живых, а не фиксированных дофаминергических нейронов в первичных вентральных мезенцефальных культурах.

Первую часть процедуры будет демонстрировать Шарлин Ким, техник из лаборатории Генри Лестера. Начните со стабилизации головы эмбриона мыши с помощью щипцов, плотно расположенных на морде, чтобы спинная поверхность была доступна. С помощью щипцов, которые вы держите в другой руке, зажмите слой кожи и черепа непосредственно перед гребнем заднего мозга и отклейте кожу и череп каудиллы вдоль средней линии.

Поместите щипцы вокруг гребня так, чтобы один кончик находился между корой и мезонцефалоном, а другой — над мозжечком. Сощипните и удалите весь средний мозг. Поместите средний мозг в чашку Петри с холодным HBSS под препарирующим микроскопом.

Под препарирующим микроскопом переверните сегмент мозга так, чтобы теперь была доступна вентральная сторона. Теперь видны четыре квадранта. Удалите все мозговые оболочки и сосудистую сеть, осторожно захватив мозговые оболочки щипцами и потянув вверх от мозга.

Далее поместите один щипец щипцов в желудочек примерно в центре сегмента. Затем, чтобы отделить средний мозг, сделайте защемление дорсально, а затем ущипните медиально с каждой стороны. Возьмите два нижних квадранта, сделав боковые надрезы с обеих сторон.

Вентральная тегментальная область и substantia nigra pars compacta находятся в вентральном нижнем отделе, который выглядит плотным. Поместите рассеченную ткань, содержащую как VTA, так и SNC в свежем HBSS, в отдельную область чашки Петри. После рассечения всех сегментов мозга с помощью щипцов и скальпеля номер 11 разрежьте каждый участок среднего мозга на части примерно одинакового размера.

Затем с помощью наконечника пипетки P1000 с широким отверстием перенесите все четвертые сегменты среднего мозга в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Дав ткани осесть и удалив HBSS, добавьте 500 микролитров раствора папаина. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После инкубации используйте наконечник P1000 с широким отверстием, чтобы перенести только сегменты среднего мозга в одну миллилитровую аликвоту раствора ДНКазы I и позволить сегментам осесть на дно трубки. Затем перенесите только сегменты среднего мозга в 15-миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр раствора для холодной остановки. Замените второе полоскание одним миллилитром свежего раствора и семь раз проведите пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника для пипетки P1000, чтобы растирать клетки.

Затем подложите клеточную суспензию путем медленного пипетирования 200 микролитров 4%-ного раствора БСА на дно пробирки. После центрифугирования при давлении 280 x g в течение шести минут аспирируйте надосадочную жидкость с помощью P1000 и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре гальванической среды. Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра, а затем разбавьте клеточную суспензию до 1000 клеток на микролитр с гальванической средой.

Нанесите 120 мкл клеточной суспензии на поли-D-лизин, поли-L-орнитин и ламинин покрытые культурой чашки сразу после аспирации ламинина, чтобы покрытие не высыхало и не образовывало неровную поверхность. Затем, после одного часа инкубации, осторожно добавьте три миллилитра питательной среды в незасеянный участок чашки для культивирования, чтобы свести к минимуму нарушение работы клеток. После трех недель культивирования промойте чашку для посева двумя миллилитрами PBS Dulbecco's PBS, не содержащим РНКазы.

Снимите DPBS. Затем замените на один миллилитр свежего DPBS для заготовки. Используйте набор фильтров GFP и объектив 40X на инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе для идентификации флуоресцентных TH-положительных нейронов в культурах.

С помощью микроманипулятора проведите пипетку над клеточной сомой. Затем используйте пластиковую трубку, прикрепленную к боковому порту держателя микропипетки, чтобы мягко отсосать, чтобы аспирировать нейрон в стеклянную микропипетку. Немедленно извлеките микропипетку, содержащую клетку, из раствора для ванны и поместите наконечник в ПЦР-пробирку объемом 0,2 млилтера, содержащую реакционный буфер.

Сломайте кончик о стенку трубки у дна. Затем поместите стерильную иглу шприца 21 калибра в заднюю часть микорпипета и надавите, чтобы вытолкнуть остатки жидкости из сломанного кончика микропипетки. Центрифугируйте сборную пробирку в течение пяти секунд с помощью настольной микроцентрифуги, а затем заморозьте ее в сухом льду.

Во время работы в ПЦР-камере с реагентами на льду, или на чиллерном блоке, приготовьте первую штаммовую мастер-смесь плюс 10% дополнительного объема при комнатной температуре. И один микролитр трех основных праймеров, один и один микролитр количественно определенных РНК-спайков к образцу. Затем инкубируйте образец в термоамплификаторе в течение трех минут при температуре 72 градуса Цельсия, а затем поместите образцы непосредственно на решетку-охладитель ПЦР.

Далее добавьте 5,5 микролитров подготовленной мастер-смеси в реакционную пробирку в штативе-охладителе для ПЦР и аккуратно перемешайте пипетированием. После центрифугирования пробирки в течение пяти секунд инкубируйте в амплификаторе, установленном на параметры, показанные сейчас на экране. Для очистки кДНК первой нити добавьте в образец 25 микролитров вихревых магнитных шариков комнатной температуры.

Перемешивайте, дозируя весь объем вверх и вниз не менее 10 раз. Затем инкубируйте при комнатной температуре в течение восьми минут, чтобы кДНК могла соединиться с бусинами. Затем поместите образцы и магнитные шарики на устройство магнитной сепарации до тех пор, пока жидкость не станет полностью прозрачной и в надосадочной жидкости не останется гранул.

Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Вращайте образец в течение пяти секунд, чтобы собрать жидкость со стороны пробирки. Поместите образцы на устройство магнитной сепарации на 30 секунд.

Затем удалите всю оставшуюся надосадочную жидкость с помощью пипеттера Р10, чтобы остались только шарики со связанной ДНК. Добавьте 50 микролитров мастер-смеси ds-cDNA PCR, а затем запустите программу ПЦР с синтезом второй цепи, чтобы получить двухцепочечную кДНК. Эта гистограмма показывает количество генов, кодирующих белки, обнаруженных в библиотеках секвенирования дофаминергической РНК отдельных клеток, полученных из TH-eGFP-положительных клеток, в количестве фрагментов на килобазу транскрипта на миллион картированных прочтений.

От 6 000 до 8 000 белковых генов были обнаружены в библиотеках отдельных клеток. После освоения этого метода можно сделать за четыре-пять недель, включая время на получение клеток, обеспечение созревания клеток в культуре, этапы сбора клеток и создания библиотеки, секвенирование библиотек и предварительный анализ. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо сохранить свободное от РНК рабочее пространство для создания библиотеки РНК и сбора клеток, поддерживать стерильные методы культивирования клеток и изготавливать пипетки соответствующего размера диаметра для сбора одиночных клеток.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует принимать меры предосторожности, такие как использование вытяжного шкафа, избегание контакта с кожей и глазами, держание вдали от тепла и открытого огня, а также ношение соответствующей индивидуальной защитной одежды. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как экспрессия генов и анализ генных сетей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как лекарственное лечение влияет на экспрессию белка в дофаминергических клетках.