Изучение Митохондриальная Структура и функции в Drosophila Яичники

Общей целью данной процедуры является демонстрация методов изучения структуры и функции митохондрий как в живых, так и в неподвижных тканях модельного организма Drosophila melanogaster. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области митохондриальной биологии. Например, регуляторные механизмы функции митохондрий.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить детальный анализ взаимосвязи между митохондриальной структурой и функцией. Отсортировав пять обезболенных самок мухи согласно текстовому протоколу, под микроскопом вскрытия с помощью двух пар щипцов отделите грудную клетку от брюшной полости. Затем аккуратно переложите брюшко во вторую лунку посуды.

Используя одну пару щипцов, чтобы удерживать живот на заднем конце, используйте другую пару щипцов, чтобы медленно вытолкнуть яичники. Затем с помощью щипцов удерживайте отдельный яичник за непрозрачный задний конец и осторожно переместите его к третьему отверстию чашки для дразнения или фиксации. Осторожно подразните защитную оболочку вокруг яичников, используя пару щипцов, чтобы удерживать задний конец, и слегка проводя дразнящей иглой от заднего к переднему концу.

Чтобы приготовить камеры, покрытые полилизеном, поместите две разделенные капли полилисена по 20 микролитров на покровное стекло чашки Петри со стеклянным дном. Высушите пластины на воздухе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа и нанесите полилизин на нижнюю сторону пластины. Установите параметры сканирования на конфокальном микроскопе, открыв программное обеспечение для получения изображений, и на вкладке сбора данных установите соответствующие параметры сканирования.

Установите флажки «Временные ряды», «Обесцвечивание» и «Регионы», чтобы открыть отдельные вкладки. Затем введите соответствующие значения параметров сбора данных в каждую вкладку. Затем поместите один рассеченный и подвергшийся воздействию яичник на отмеченную область, покрытую полилизином, и с помощью иглы раздразните яичник и разделите яичники.

Нанесите каплю 10 микролитров препарирующей среды на завязь, убедившись, что она покрывает всю область, покрытую полилизином. Затем накройте чашку Петри крышкой. Сразу после установки яичника поместите образец на предметный столик микроскопа и с помощью окуляра быстро определите интересующее его поле в живой ткани.

Нажмите кнопку «В реальном времени», чтобы получить изображение в реальном времени для выбранной области интереса, затем нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить сканирование в реальном времени. При необходимости отрегулируйте параметры регистрации таким образом, чтобы обнаруженный флуоресцентный сигнал был ниже уровней насыщения с заданным фоном, заданным путем регулировки значений смещения. На вкладке «Графика» с помощью инструмента рисования Безье нарисуйте небольшую рентабельность инвестиций, чтобы обозначить зону обесцвечивания фотографий на изображении, полученном в результате сканирования.

Затем выполните получение изображения, нажав на кнопку «Начать эксперимент». Для проведения живого окрашивания флуоресцентными митохондриальными красителями запас красителей разводят в теплой препарирующей среде до конечных рабочих концентраций. После того, как вскрытие и поддразнивание будут продемонстрированы ранее, поместите яичники в 200 микролитров красящего раствора в лунку для вскрытия.

Накройте тарелку коробкой, обернутой алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света, и выдержите ткань в течение 10 минут. Затем промойте окрашенные яичники с помощью щипцов, чтобы осторожно переместить их в три последовательные лунки, содержащие среду без окрашивания. Для совместного окрашивания с ТМРЭ в совместимом общем митрохондриальном окрашивании сначала проводят окрашивание ТМРЭ, а затем, не промывая ткань, немедленно переносят образец в общее митохондриальное окрашивание.

После промывки и установки яичников, как показано ранее в этом видео, чтобы выполнить конфокальную визуализацию образца, установите флажок z-сечения, чтобы открыть вкладку. Поверните фокусировочное колесо в нижнюю часть образца во время его сканирования в реальном времени и нажмите на кнопку «Установить» первым, чтобы определить самый нижний z-образный срез. Затем переместите колесо фокусировки в противоположном направлении, чтобы определить самую верхнюю секцию.

Выполните получение изображения, нажав на кнопку «Начать эксперимент». В случае живой xvivamicrosкопии данные должны быть получены в течение 15 минут после монтажа ткани, в противном случае на результаты эксперимента могут повлиять изменения физиологии из-за последующей гибели ткани. Сразу после вскрытия под вытяжной шкаф поместите яичники в 200 микролитров свежей комнатной температуры PFA в лунку стеклянной посуды для препарирования.

Инкубируйте ткань в течение 15 минут, чтобы зафиксировать ее. После промывания яичников в PBS в соответствии с текстовым протоколом, все еще находясь в PBS, дразните яичники, чтобы осторожно удалить защитную волокнистую оболочку, которая может препятствовать доступу антигена к антителам. Пропитайте яичники, поместив их в микропредохранительную пробирку с 500 микролитрами 0,5 процента тритана x 100 в PBS.

Затем поместите трубку в закрытую коробку и установите на 25 оборотов в минуту на 30 минут. Удалите PBS/TX в соответствии с текстовым протоколом, заблокируйте ткань, добавив 200 микролитров BSA, растворенных в 0,5% PBS/TX. Инкубируйте образцы на коромысле при комнатной температуре в течение часа.

После удаления блокирующего раствора добавьте антибедидный десиклин Е и антитела против мышиного АТФБ. Инкубируйте ткань на коромысле при комнатной температуре в течение двух часов. После инкубации используйте PBS-TX для промывания яичников три раза по 15 минут каждый.

Затем добавьте 200 микролитров соответствующих вторичных антител и свежий PBS-TX и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. Промыв ткань два раза, добавьте крючки к третьей промывке. Затем с помощью микропипетки объемом в один миллилитр удалите окрашенные иммунитетом яичники из микрофитловидной трубки в свежую лунку стеклянной чашки для препарирования, содержащей 200 микролитров PBS.

Добавьте одну каплю монтажного средства на основе глицерина на предметное стекло и добавляйте иммуноокрашенные яичники по одному в монтажную среду. Под диссекционным микроскопом, удерживая непрозрачную часть яичника щипцами, с помощью дразнящей иглы аккуратно выщипывают прозрачные яичники из непрозрачных камер зрелых яйцеклеток. Затем снимите камеры со зрелыми яйцами из монтажной среды.

Поместите защитное стекло на предметное стекло и слегка нажмите, чтобы монтажная среда равномерно распределилась. Высушите образцы на воздухе в течение 15 минут, прежде чем использовать лак для ногтей для запечатывания краев. Наконец, при необходимости проведите конфокальную микроскопию.

Как показано на рисунке, флип, направленный на одно из митохондриальных облаков, связанных с нерсовыми клетками, приводит к более чем 50-процентной потере флуоресцентного сигнала от синего и белого ROI, окружающих красный ROI, в течение 200 секунд, в то время как желтый контроль ROI минимально обесцвечен. Яичники дрозофил демонстрировали снижение сигнала с глубиной ткани, и важно различать максимальную глубину ткани, в которой могут быть обнаружены флорофоры, такие как ТМРЭ и митостейн, во время визуализации в реальном времени. Качественный анализ совместного окрашивания с TMRE и общего митохондриального окрашивания показывает, что drisophilla germarium демонстрирует более высокий митохондриальный потенциал на единицу массы на стадии 2B.

На этом рисунке полукачественный анализ демонстрирует разницу в митохондриальном потенциале на единицу массы между AFC и MBC, проанализированной из яйцевой камеры 9-й стадии. Эти изображения показывают, что поглощение митосокса происходит в клетках фолликула митотической и постмитотической дризофилы. В этом эксперименте коиммунологическое окрашивание выявляет повышенный дециклиновый сигнал, перекрывающийся с митохондриальным сигналом АТФБ и клонами нолов GFP отрицательного DRP1 в Germarium и в яйцевой камере 9 стадии.

Описанные методы могут быть модифицированы и использованы для изучения функции митохондриальной структуры в других тканях дризофилы. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как препарировать, окрашивать и визуализировать неподвижные и живые дризофильные яичники для изучения структуры и функции митохонриальных клеток.