В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за эффективностью антимикробной терапии синим светом при инфекциях acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью при ожогах мышей. Этот протокол может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области антимикробного подхода, основанного на свете, например, эффективен ли антимикробный синий свет в устранении локализованных бактериальных инфекций. В том числе и более близкие по штаммам с множественной лекарственной устойчивостью.

Основное преимущество антимикробного синего света заключается в том, что он является неантибиотическим подходом без участия экзогенного фотосенсибилизатора и, вероятно, не наносит вреда клеткам и тканям хозяина. Применение этого метода распространяется на терапию бактериальных инфекций с множественной лекарственной устойчивостью, поскольку антимикробный синий свет убивает патогенные бактерии независимо от их лекарственной устойчивости. Хотя этот метод может дать представление об антимикробном действии синего света на ожоговые инфекции acinetobacter baumannii, он также может быть применен к другим типам локализованных инфекций, вызванных другими видами бактерий.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы изучали использование простых антимикробных подходов на основе света против локализованных инфекций с множественной лекарственной устойчивостью. После обезболивания мыши, согласно текстовому протоколу, используйте машинку для стрижки волос с 50 лезвиями, чтобы побрить мышь на спине, чтобы обнажить как можно больше кожи. Затем поместите крышку 35-миллиметровой чашки Петри под брюшко мыши, чтобы спина оставалась в относительно горизонтальном положении.

Используйте конфорку размером 10 на 10 дюймов 220 В переменного тока, чтобы вскипятить воду в стакане объемом 150 миллилитров. Погрузите латунный брусок в стакан до тех пор, пока не будет достигнуто тепловое равновесие с водой. Перед созданием ожоговой травмы введите подкожную инъекцию упреждающих анальгетиков для облегчения боли.

Через 10 минут, надев термоперчатки, осторожно прижмите нагретый латунный блок к выбритому участку на тыльной стороне мыши в течение семи секунд, чтобы вызвать ожоговые раны. Для предотвращения гидратации вводят 0,5 миллилитра стерильного физиологического раствора через подкожные инъекции. Через пять минут после индукции термической травмы с помощью пипетки на ожоги мышей ввели 50 микролитров бактериальной суспензии, содержащей пять раз по 10 до шестого КОЕ и PBS.

Затем, двигая стерильным ватным тампоном зигзагообразными движениями по коже, намажьте аликвотой ожоги, чтобы максимально равномерно распределить бактериальные клетки в обожженном участке. Сразу после инокуляции проведите биолюминесцентную визуализацию, запустив программное обеспечение для визуализации в реальном времени. В панели управления нажмите кнопку «Инициализировать».

Затем подождите, пока цвет температурного бокса не станет зеленым, указывая на то, что температура предметного столика в камере для образцов достигла 37 градусов по Цельсию. Поместите мышь под наркозом на теплую сцену в камеру для образцов с инфицированными ожогами прямо под камерой. Далее в панели управления поставьте галочку напротив люминесцентной.

Затем выберите автоматическую экспозицию, чтобы время экспозиции для визуализации было оптимизировано программным обеспечением для визуализации в реальном времени на основе интенсивности биолюминесценции. Выберите C в раскрывающемся списке поля зрения. Выберите параметр среднего диапазона кожи, чтобы программное обеспечение определило фокусное расстояние.

Затем поставьте галочку рядом с надписью «Наложение». Теперь нажмите кнопку «Получить», чтобы сделать снимок. Затем в поле редактирования метки изображения нажмите OK.

Появится окно изображения и палитра инструментов. Установите параметры Auto-ROI для автоматического выбора. Через 24 часа после бактериальной инфекции для проведения антимикробной терапии синим светом используйте разъемы-зажимы, чтобы закрепить светодиод на оптическом опорном стержне, чтобы светодиод мог двигаться вверх и вниз.

После того как измеритель мощности будет включен и выбрана длина волны 415 нанометров, поместите измеритель электрической энергии прямо под светодиод. Надев защитные очки от синего света, включите светодиодную подсветку и отрегулируйте расстояние между светодиодной апертурой и датчиком освещенности измерителя электроэнергии таким образом, чтобы световое пятно охватывало всю площадь датчика света. Тщательно настройте светодиодный драйвер T-cube и запишите показания счетчика электроэнергии.

Рассчитайте интенсивность излучения в соответствии с показаниями. Отрегулируйте излучение светодиода до 100 милливатт на квадратный сантиметр, настроив светодиодный драйвер T-cube. Затем выключите светодиод и измерьте расстояние между апертурой светодиода и датчиком освещенности измерителя мощности.

После обезболивания мышей, согласно текстовому протоколу, случайным образом разделите животных на группу с антимикробным синим светом или aBL и контрольную группу, не получавшую лечения. Для группы, обработанной aBL, используйте алюминиевую фольгу, чтобы закрыть глаза мышей, чтобы избежать чрезмерного воздействия света. Поместите мышь Burns непосредственно под светодиод с крышкой 35-миллиметровой чашки Петри под брюшную полость мыши, чтобы держать спину в горизонтальном положении.

Далее замените измеритель мощности на мышку на квадратную чашку Петри. Затем отрегулируйте высоту мыши до положения, при котором расстояние между апертурой светодиода и поверхностью горения мыши равно расстоянию между апертурой светодиода и датчиком освещенности измерителя мощности. Облучайте зараженные ожоги с интенсивностью излучения 100 милливатт на квадратный сантиметр.

Вводите aBL в аликвотах 72 джоуля на квадрат сантиметра до тех пор, пока не будет достигнута общая доза в 360 джоулей на квадратный сантиметр. После каждой дозы света выполняйте биолюминесцентную визуализацию ожогов мышей, как было показано ранее в этом видео. Для контрольной группы, не получавшей лечения, выполните биолюминесцентную визуализацию ожогов мышей с использованием тех же временных интервалов, что и для группы, получавшей ABL.

Бактериальный штамм A.baumannii был сделан биолюминесцентным путем трансфекции luxCDABE opera. На этом рисунке показаны последовательные изображения бактериальной люминесценции от типичного мышиного ожога, зараженного пятью раз по 10 до шестого A.baumannii и подвергшегося воздействию 360 джоулей на квадрат aBL, через 24 часа после бактериальной инокуляции. Как показано на этой панели, бактериальная люминесценция была практически уничтожена после облучения aBL в 360 джоулей на квадрат сантиметра.

Здесь показано окрашивание гистологического среза репрезентативного образца с ожогом кожи мыши, собранного через 24 часа после инокуляции, что свидетельствует о наличии биопленок A.baumannii на поверхности инфицированного ожога. На этом графике показана кривая реакции на дозу средней бактериальной люминесценции от ожогов мышей, инфицированных пятью раз по 10 до 6 A. baumannii и получавших aBL через 24 часа после бактериальной инокуляции. Для достижения инактивации A.baumannii по основанию 10 в ожогах мышей требовалось примерно 360 джоулей на сантиметр в квадрате aBL.

Бактериальная люминесценция ожогов мышей без воздействия aBL оставалась практически неизменной в течение эквивалентного периода времени. После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно получить доступ к биолюминесцентным штаммам бактерий.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области антимикробной терапии, основанной на свете, чтобы изучить использование антимикробного синего света без экзогенного фотосенсибилизатора против локализованных бактериальных инфекций, в том числе вызванных штаммами с множественной лекарственной устойчивостью. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать противомикробный синий свет для профилактики и лечения локализованных инфекционных заболеваний. Не забывайте, что работа с видимым светом и болезнетворными бактериями может быть крайне опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторных перчаток и светозащитных очков.