Низкая плотность первичного гиппокамп Нейрон культура

Данный протокол был первоначально опубликован доктором Гэри Банкером и его коллегами; он позволяет получать культуры эмбриональных гиппокампальных нейронов с низкой плотностью и высокой степенью чистоты путем размещения нейронов над фильтрующим слоем глии. Этот результат является преимуществом по сравнению с нашими другими результатами культивирования гиппокампа, так как он позволяет нейронам расти при низкой плотности с минимальным количеством contaminating-глиальных клеток. Таким образом, данный метод идеально подходит для визуализации высокого разрешения и функционального анализа зрелых нейронов в культуре.

Пост-созревание в данном протоколе должно ускорить адаптацию к новым условиям, так как в ходе процедуры есть несколько ключевых этапов, которые сложно описать, поэтому руководство проведет вас по всем шагам. Этот протокол включает работу с тремя независимыми популяциями, необходимыми для культивирования первичных нейронов высокого качества. Эти процессы включают культивирование глиальных клеток, создание и покрытие покровных стекол, а также подготовку нервных клеток гиппокампа.

Для начала необходимо получить кортикальную ткань крысы раннего постнатального периода, как описано в письменном протоколе. Хотя это не показано здесь напрямую, обратите внимание, что этапы препарирования, представленные далее в данном протоколе, почти идентичны тем, что используются при препарировании коры. По этой причине соответствующие шаги будут выделены во время процедуры препарирования гиппокампа, показанной далее в этом видео.

Начиная с шестого этапа письменного протокола, удалите HBSS из собранной ткани коры головного мозга, после чего максимально мелко измельчите ткань с помощью ножниц. Добавьте в измельченную ткань достаточное количество HBSS, чтобы перенести фрагменты ткани в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, затем доведите общий объем до 12 миллилитров, добавив HBSS. Добавьте по 1,5 миллилитра 2,5% трипсина и раствора ДНК с концентрацией 10 milligram per milliliter, переверните пробирку для перемешивания, затем инкубируйте полученную смесь в водяной бане при температуре 37 degree Celsius в течение 12 минут.

Разотрите ткань от 10 до 15 раз с помощью стеклянной пастеревской пипетки, затем инкубируйте ее в водяной бане еще в течение трех минут. Убедитесь, что все фрагменты ткани осели на дно пробирки, после чего отфильтруйте супернатант в коническую пробирку объемом 50 milliliter, содержащую 5 milliliters BGS. Добавьте 13.5 milliliters HBSS и 1.5 milliliters 2.5% трипсина в пробирку с оставшимися фрагментами непереваренной ткани, перемешайте путем переворачивания, затем инкубируйте в водяной бане еще 10 минут.

После инкубации подвергните оставшуюся ткань тритурации 10–15 раз, затем профильтруйте её в пробирку с первым фильтратом. Далее промойте фильтр, пропустив через него дополнительные 3 миллилитра BGS. На этом этапе фильтрат можно разделить по нескольким пробиркам, чтобы упростить как балансировку, так и повторное суспендирование осадка клеток.

Центрифугируйте суспензии в течение шести минут при 130 G. После центрифугирования обратите внимание, что нижняя часть осадка имеет слегка красноватый оттенок из-за наличия компонентов крови. Удалите супернатанты, затем добавьте в каждую пробирку 1 миллилитр глиальной среды, стараясь не повредить осадок. Перенесите те части каждого осадка, которые не имеют красноватого оттенка, в новую коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Добавьте до 2 миллилитров глиальной среды на одного детеныша, чтобы ресуспендировать объединенную ткань, и перенесите каждые 2 миллилитра суспензии в 18 миллилитров предварительно прогретой глиальной среды в культуральный флакон площадью 75 квадратных сантиметров. Инкубируйте флакон в инкубаторе при 37 degrees Celsius и 5%CO2. На следующий день после посева клеток замените среду в каждом флаконе на свежую глиальную среду.

Обратите внимание, что на данном этапе культура будет представлять собой смесь астроцитов и других нецелевых типов клеток. Чтобы удалить клетки, не являющиеся астроцитами, через четыре дня после посева необходимо подвергнуть флаконы интенсивному перемешиванию. Для этого промойте флаконы раствором HBSS, затем добавьте в каждый флакон по 10 миллилитров свежего HBSS и энергично встряхните каждый из них от 5 до 10 раз.

Аспирируйте HBSS и промойте образец еще дважды с помощью HBSS. Затем добавьте 20 миллилитров глиальной среды и верните флаконы в инкубатор, как и прежде. Обратите внимание, что несмотря на интенсивность промывки, астроциты, необходимые для культивирования, останутся прочно прикрепленными к поверхности флакона.

Для поддержания культур астроцитов дважды в неделю заменяйте среду на свежую глиальную среду до достижения клетками конфлюэнтности. После достижения конфлюэнтности клетки можно заморозить для последующего использования, как описано в письменном протоколе. Глию необходимо высеять в чашки минимум за 14 дней до начала культивирования нейронов, согласно описанию в письменном протоколе.

Погрузите покровные стекла в концентрированную азотную кислоту и подвергните их воздействию ультразвука в течение 30 минут при комнатной температуре. Соблюдайте осторожность, так как концентрированная азотная кислота обладает крайне едким действием. Обратите внимание, что в некоторых лабораториях предпочитают вымачивать покровные стекла в азотной кислоте в течение ночи, используя керамические штативы для окрашивания.

Осторожно утилизируйте азотную кислоту в вытяжном шкафу в соответствии с правилами учреждения, затем промойте покровные стекла трижды деионизированной водой. Погрузите покровные стекла в воду и снова подвергните их воздействию ультразвука в течение 30 минут. Затем слейте воду и промойте покровные стекла еще три раза.

Погрузите покровные стекла в 50 milliliters воды, затем подвергните их автоклавированию. В стерильном ламинарном шкафу удалите воду и добавьте 20 to 30 milliliters этанола для промывки. Добавьте еще 20 to 30 milliliters этанола, после чего перенесите покровные стекла вместе с этанолом в чашку Петри диаметром 100 millimeter.

С помощью тупых пинцетов перенесите окрашенные покровные стекла в чашки Петри объемом 60 миллилитров, по четыре-пять штук в одну чашку, затем дайте им высохнуть на воздухе, прислонив стекла к краю чашки. После испарения этанола верните покровные стекла в горизонтальное положение. Растопите 10 граммов парафина в термостойком стеклянном флаконе, поддерживая температуру примерно от 150 до 200 градусов Цельсия.

Возможно, потребуется некоторая корректировка температуры, так как неправильный температурный режим может затруднить получение парафиновых ножек нужного размера. Окуните пипетку Пастера в парафин, затем быстро коснитесь трех точек по краю каждого покровного стекла. Капли парафина затвердеют, образовав сферы высотой примерно 3–5 мм и диаметром 1–2 мм, которые создадут необходимое пространство между нейронами на покровном стекле и нижележащим глиальным монослоем.

Возьмите чашки с предварительно подготовленными покровными стеклами с парафиновыми ножками. Нанесите 200 µL поли-L-лизина и боратного буфера на поверхность каждого покровного стекла и оставьте раствор на стеклах на ночь, накрыв их, при комнатной температуре. Покрывать следует ту же поверхность, на которой расположены парафиновые гранулы.

При правильной очистке поли-L-лизин должен легко распределяться, покрывая поверхность покровного стекла. На следующее утро промойте покровные стекла дважды, вымачивая их в стерильной воде по два часа за каждое промывание. После окончательного промывания замените воду 4 миллилитрами plating medium на одну чашку.

Обратите внимание на то, что крайне важно не допускать высыхания поверхности покровных стекол после их обработки поли-L-лизином. Поместите чашки с покровными стеклами в инкубатор при температуре 37 °C. Покрытые покровные стекла должны инкубироваться не менее 24 часов до начала культивирования нейронов.

Возьмите беременную крысу на 18-й или 19-й эмбриональный день и проведите эвтаназию утвержденным методом. Обработайте нижнюю часть тела крысы 70% ethanol, затем сделайте разрез по срединной линии от паховой области до конца брюшной полости. Чтобы избежать контаминации, на данном этапе будьте осторожны и рассекайте только кожу.

Стерилизуйте инструменты для диссекции 70% ethanol, затем сделайте разрез брюшной стенки, чтобы обнажить матку. Извлеките два рога матки и поместите их в стерильную чашку. В стерильном ламинарном шкафу удалите плодные оболочки, окружающие плоды, затем обезглавьте их и поместите головы в чашку Петри объемом 100 millimeter, содержащую 20 milliliters HBSS.

Выделите головной мозг и немедленно поместите его в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 2 мл HBSS на льду. Помещайте в одну чашку не более двух-трех образцов мозга, чтобы обеспечить достаточное пространство для следующего этапа. Под диссекционным микроскопом удалите мозговые оболочки от срединной линии полушарий головного мозга.

Затем аккуратно выделите гиппокампы. Обратите внимание, что гиппокамп представляет собой серповидную структуру на медиальной поверхности коркового полушария; его легко удалить, так как с латеральной стороны он ограничен желудочком. После извлечения поместите гиппокампы в чашку Петри диаметром 60 millimeter, содержащую 4,5 milliliters HBSS, и держите на льду.

Обратите внимание, что этапы, выполненные до этого момента, также применимы к диссекции коры, за исключением того, что сохраняются отделы коры, а не гиппокампы. При диссекции коры следующим шагом будет отделение коры от остальной части мозга, как показано здесь, после чего следует собрать кору и HBSS, как было описано ранее. После сбора всей ткани гиппокампа в HBSS перенесите ее в коническую пробирку объемом 15 milliliter.

Добавьте 5 milliliters 2.5%трипсина, затем инкубируйте при 37 °C в течение 10 минут. Осторожно удалите раствор трипсина с помощью пипетки Пастера, стараясь не потревожить ткань гиппокампа на дне пробирки. Промойте ткань дважды, аккуратно добавляя 5 milliliters HBSS, инкубируя при 37 °C в течение пяти минут, а затем снова удаляя раствор пипеткой Пастера, следя за тем, чтобы ткань на дне оставалась неподвижной.

Пока продолжается ранее описанный этап инкубации, подготовьте два варианта оплавленных пипеток для диссоциации ткани. Для этого подвергните кончик стеклянной пастеровской пипетки кратковременному воздействию пламени, после чего осмотрите кончик пипетки. Для первого варианта повторяйте это действие до тех пор, пока края кончика пипетки не станут гладкими, но его диаметр останется неизменным.

Для второго образца повторите процедуру до тех пор, пока края не станут гладкими, а диаметр кончика не уменьшится примерно вдвое. Важно потренироваться, чтобы подобрать оптимальный диаметр, обеспечивающий диссоциацию ткани до состояния отдельных клеток без их повреждения в процессе. После второго промывания доведите общий объем до 5 milliliters, добавив в ткань необходимый объем HBSS.

Сначала измельчите ткань гиппокампа, пропустив её примерно 10 раз через обычную пипетку с гладкими краями, затем еще 5–10 раз через пипетку с уменьшенным диаметром наконечника. Цель данного этапа — получить гомогенный клеточный раствор с полным отсутствием или минимальным количеством тканевых комков. Определите плотность клеток с помощью гемоцитометра.

Типичный выход составляет от 800 000 до одного миллиона клеток на один кокон. Перенесите достаточный объем клеточной суспензии в чашки с покровными стеклами, покрытыми поли-L-лизином, в 4 milliliters среды для посева, чтобы получить плотность посева от 100 000 до 500 000 клеток на чашку диаметром 60 millimeter, в зависимости от целей эксперимента. Поместите чашки в инкубатор при 37 degree Celsius и 5%CO2.

Через три-четыре часа перенесите покровные стекла с прикрепленными нейронами в чашки, содержащие глиальные клетки и среду NBG. Перенос следует выполнять так, чтобы сторона, на которую были высеяны нейроны, была обращена вниз, к слою глиальных клеток. В каждую чашку с глией добавьте в общей сложности четыре или пять покровных стекол.

Через два или три дня после посева добавьте раствор aerocele до конечной концентрации 5 µM на чашку, чтобы остановить рост глиальных клеток. Подкармливайте клетки один раз в неделю, заменяя 2 мл старой среды на 2,5 мл свежей среды при каждом кормлении. Дополнительный объем среды добавляется для компенсации испарения с течением времени.

Заменяют лишь часть среды, чтобы обеспечить стабильное кондиционирование среды глиальными клетками. Такие культуры обычно остаются жизнеспособными в течение как минимум одного месяца. Нейроны фиксировали 4% параформальдегидом, затем инкубировали с первичными антителами для флуоресцентной визуализации.

Как видно по иммуноокрашиванию на Tau и MAP2, эти нейроны развивают разветвленную арборизацию с хорошо сформированными аксонами и дендритами. Зрелые нейроны также развивают синаптические шипики, что определяется селективной локализацией Drebrin One; они тесно прилежат к пресинаптическим специализациям, выявленным с помощью иммуноокрашивания на synapsin I. Такие первичные нейроны хорошо подходят для функциональных и структурных исследований нейронов и синапсов, включая, помимо прочего, изучение трансдукции сигнала, нейрональной полярности, субклеточного трафика, а также развития и пластичности синапсов.

Данное видео поможет понять и точно выполнить несколько ключевых этапов этого протокола. Строгое соблюдение описанного метода должно привести к получению здоровой нейронной культуры высокой плотности с развитым разветвлением дендритов, а также морфологически и функционально полноценными синапсами.