Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Общая цель данной методологии заключается в выявлении множественного фосфорилирования внутренне неупорядоченного белка с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса с использованием тау-белка в качестве тематического исследования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы молекулярной регуляции, связанные с заболеваниями, такие как влияние фосфорилирования на взаимодействие белка с его молекулярным партнером. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем идентифицировать сайт-специфическое фосфорилирование в неупорядоченном белке и связать его со структурными и функциональными изменениями.

Этот метод может дать представление о функции. Он также может быть применен к другим белкам, таким как неупорядоченные остатки белка ДНК вируса aPtc. Применение этого метода распространяется на терапию путем разработки белка, ингибиторов взаимодействия белков. Этот метод продемонстрируют Клеман Данис, Клеман Депре, Луиза Бесса и Хамида Мерзуги, аспиранты из нашей группы.

Для начала аккуратно смешайте 50 микролитров компетентных клеток BL21 со 100 нанограммами плазмидной ДНК, образуя от 10 до 15 миллионов колоний на микрограмм плазменной ДНК в пластиковой пробирке объемом 1,5 миллилитров. Поместив клеточную смесь на лед на 30 минут, подвергните ее тепловому удару в течение 10 секунд при температуре 42 градуса Цельсия. Затем поместите тюбик обратно на лед на пять минут, прежде чем добавить один миллилитр Luria Bertani комнатной температуры или LB medium.

Инкубируйте бактериальную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут при слабом перемешивании. С помощью разбрасывателя равномерно распределите 100 микролитров клеточной суспензии на агаровую пластину среды LB, содержащей 100 микрограммов на миллилитр антибиотика ампициллина. Инкубируйте отборочную пластину в течение 15 часов при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем растворите 300 миллиграммов среды, обогащенной азотом-15 и углеродом-13, один грамм азота-15-хлорида аммония и два грамма глюкозы, меченной углеродом-13, в 10 миллилитрах среды М9. Фильтр стерилизует изотопный раствор непосредственно в среде M9 с помощью фильтра 0,2 микрона. С помощью пастеровской пипетки суспендируют одну колонию рекомбинантных плазменных трансформированных бактерий из селекционного планшета в 20 миллилитров LB среды, дополненной 100 микрограммами на миллилитр ампициллина.

Инкубируйте инокулированную среду при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно шести часов. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометрах или OD600, используя один миллилитр десятикратного разведения бактериальной культуры в пластиковой кювете спектрометра. Затем добавьте 20 миллилитров насыщенной культуры LB к одному литру питательной среды M9 с добавлением ампициллина в двухлитровую стеклянную колбу для культуры Эрленмейера.

Поместите колбу с культурой в программируемый инкубатор, установленный на 10 градусов Цельсия и 50 об/мин. Запрограммируйте инкубатор на переключение на 200 об/мин и 37 градусов Цельсия рано утром следующего дня. Измерьте OD600 на одном миллилитре бактериальной культуры в пластиковой кювете спектрометра.

Добавьте 400 микролитров одного молярного стокового раствора IPTG, когда OD600 достигнет значения около 1,0, чтобы индуцировать экспрессию рекомбинантного тау-белка. После инкубации бактериальных клеток при температуре 37 градусов Цельсия в течение дополнительных трех часов соберите их центрифугированием при 5000 г в течение 20 минут. Разморозьте бактериальную клеточную гранулу и тщательно повторно суспендируйте ее в 45 миллилитрах катионобменного буфера А, только что дополненного 1х коктейлем ингибиторов протеазы DNasel 1.

Разрушайте бактериальные клетки с помощью гомогенизатора высокого давления при давлении 20 000 фунтов на квадратный дюйм, необходимо три-четыре прохода, чтобы адекватно разрушить клетки. Центрифугируйте разрушенные клетки при 20 000 раз больше g в течение 40 минут, чтобы удалить нерастворимый материал. Нагрейте экстракт бактериальной клетки в течение 15 минут при температуре 75 градусов Цельсия с помощью водяной бани.

Белый осадок будет наблюдаться уже через несколько минут. Затем центрифугируйте нагретый экстракт при 15 000 г в течение 20 минут и держите надосадочную жидкость, содержащую термостабильный тау-белок. Затем проведите катионообменную хроматографию на прочной смоле CEX, упакованной в столбик объемом 5 миллилитров, с помощью системы быстрой жидкостной хроматографии с белком.

Установите скорость потока на уровне 2,5 миллилитров в минуту и уравновесьте колонку в буфере CEX A. Затем загрузите нагретый экстракт тау-белка объемом от 60 до 70 миллилитров с помощью насоса для отбора проб, соберите проточный материал для анализа, чтобы убедиться, что тау-белок эффективно связывается со смолой. Промойте смолу буфером CEX A до тех пор, пока абсорбция на 280 нанометрах не вернется к базовому значению.

Запрограммируйте FPLC с градиентом до 25% буфера CEX B в 10 объемах колонки для достижения 250 миллимоляров хлорида натрия. Затем добавьте 50% буфер CEX B в пяти объемах колонки, чтобы получить 500 миллимолярных хлоридов натрия. Наконец, увеличьте градиент до 100% буфера CEX B в двух объемах колонки, чтобы получить один моляр хлорида натрия.

Соберите 1,5 миллилитровые фракции во время этапов элюирования. Затем выполните обмен буфером на тау, содержащем объединенные дроби. Уравновесьте колонну обессоливания слоем G25 объемом 53 миллилитра в 15-миллиметровом буфере бикарбоната аммония с помощью системы FPLC.

Установите скорость потока на уровне пяти миллилитров в минуту и введите образец тау-белка в колонку через петлю впрыска объемом пять миллилитров. Соберите дроби, соответствующие пику поглощения на 280 нанометрах. Объедините все тау-фракции перед распределением образца по пробиркам.

Выбирайте эти трубки так, чтобы объем раствора был небольшим по сравнению с объемом пробирки. Затем проделайте отверстия в крышках пробирок с помощью иглы перед замораживанием образцов тау при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующей лиофилизации. Солюбилизируйте четыре миллиграмма лиофилизированного азота 15 и углерода 13, обогащенного фосфорилированным тау-веществом erk в 400 микролитрах ЯМР-буфера.

Добавьте пять процентов оксида дейтерия для блокировки поля ЯМР-спектрометра и один миллимолярный TMSP в качестве внутреннего эталонного сигнала ЯМР. Также добавьте 10 микролитров стокового раствора 40 EK полного коктейля ингибиторов протеазы. Перенесите образец в пятимиллилитровую ЯМР-пробирку с помощью электронного шприца с длинной иглой или с помощью пастеровской пипетки.

Закройте ЯМР-трубку с помощью поршня. Удалите пузырьки воздуха, застрявшие между поршенем и жидкостью, перемещая поршень. Поместите ЯМР-трубку в вращающуюся вертушку.

С помощью соответствующего манометра отрегулируйте его вертикальное положение в спиннере таким образом, чтобы большая часть раствора образца находилась внутри катушки ЯМР. Затем запустите воздушный поток в приборе ЯМР, нажав кнопку «Подъем» в окне «Система управления магнитами». Осторожно поместите блесну с трубкой в воздушный поток в верхней части отверстия магнита.

Затем остановите поток воздуха и позвольте трубке опуститься на место внутри головки зонда внутри магнита. После того, как образец уравновесится до 25 градусов Цельсия, введите ATMM в командной строке, чтобы выполнить полуавтоматическую настройку и согласование головки зонда для оптимизации передачи мощности. Затем нажмите кнопку «Замок» в окне «Система управления магнитами», чтобы включить блокировку частоты поля спектрометра.

Запустите процедуру шимминга для оптимизации однородности магнитного поля в положении образца, сначала набрав TopShim GUI в командной строке, чтобы открыть окно прокладки. Затем нажмите кнопку «Пуск» в окне прокладки совместимости. Проверьте остаточное стандартное отклонение B0, чтобы убедиться в оптимальности регулировочных прокладок.

Далее откалибруйте параметр P1, который представляет собой длину протонного радиочастотного импульса в микросекундах. Этот параметр необходим для получения поворота спина протона на 90 градусов. Стремитесь к импульсу на 360 градусов, используя одномерный спектр водных протонов.

Отрегулируйте смещение частоты, установив параметр O1 на частоту протонной воды в одномерном спектре. Наконец, начните получение одномерного спектра протона, введя ZG в командной строке. Репрезентативный результат очистки рекомбинантного тау-белка показывает основной пик поглощения на глубине 280 нанометров, наблюдаемый во время градиента элюирования.

Этот пик соответствует очищенному тау-белку, как видно на акриламидном геле над хроматограммой. Хроматограмма для обессоливания рекомбинантного очищенного тау-белка показывает, что пик поглощения на глубине 280 нанометров и пик проводимости хорошо разделены, что обеспечивает эффективность обессоливания белка на этапе лиофилизации. Одномерный ЯМР-спектр рекомбинантного азота 15 тау на частоте 900 МГц подтверждает, что сигнал ЯМР от образца белка может быть обнаружен

Хорошее соотношение сигнал/шум указывает на то, что основные параметры сбора данных были установлены правильно. Двумерный спектр фосфорилированного белка показывает хорошее разрешение, резонансы узкие и хорошо разделены. Резонансы в области спектра, выделенные красным цветом, соответствуют фосфорилированным остаткам.

После просмотра этого видео вы сможете получить рекомбинантный белок с простым в выборе мечением, очистить этот белок и настроить основной параметр для получения спектральных данных. После освоения этого протокола его можно сделать за две недели, если он правильно организован. Не забывайте, что в ЯМР-спектроскопии используются очень сильные магниты, к которым нельзя приближаться с металлическими предметами.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что эти другие белки чувствительны к лизису протеазы, и необходимо принять ряд мер предосторожности, чтобы избежать деградации образца. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как твердотельный ЯМР, для исследования амилоидоподобных агрегатов, которые часто образуются неупорядоченными белками. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области химической биологии к исследованию активных соединений с серапатическим потенциалом в модельных системах in vitro.