Экспериментальный дизайн для лазерных микродиссекция РНК-Seq: уроки из анализа развития листьев кукурузы

Общая цель этого метода заключается в количественной оценке накопления транскриптов в конкретных клетках или клеточных доменах, чтобы можно было проводить сравнения между различными доменами или между эквивалентными доменами в образцах мутантного и дикого типа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как определение доменов органов или влияние конкретных мутаций на экспрессию генов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что накопление транскрипта может быть количественно определено в мельчайших, точно определенных областях, которые слишком малы, чтобы их можно было препарировать вручную.

Перед началом этой процедуры выращивайте рассаду кукурузы в стандартных условиях до двухнедельного возраста. Чтобы рассечь верхушки побегов на боковые срезы, сначала вырезайте саженец чуть ниже линии почвы. Затем с помощью бритвенного лезвия удалите тонкие ломтики от основания стебля, пока не станет виден овал спокойствия, окруженный одним или двумя зрелыми листьями.

Сделайте еще один срез примерно на 10 миллиметров выше основания. Этот 10-миллиметровый отрезок содержит верхушечную меристему побега у молодых листовых зачатков. Поверните 10-миллиметровый сегмент так, чтобы основание было обращено вверх.

Сделайте два разреза параллельно боковой оси, чтобы получить слайд ткани толщиной два-три миллиметра. Откажитесь от двух внешних частей и оставьте центральный срез для фиксации и внедрения. Погрузите срез ткани примерно в 10 миллилитров, закрепите в стеклянном флаконе на льду.

После того, как все образцы будут препарированы, примените вакуум, чтобы удалить пузырьки воздуха и способствовать проникновению фиксатора. Удерживайте пылесос в течение 10 минут, а затем медленно отпустите вакуум. Замените фиксатор и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи с легким встряхиванием.

На следующий день продолжайте обработку тканей для внедрения, как описано в текстовом протоколе. Чтобы отлить парафиновые блоки, поместите закладные формы на горячую плиту станции для заделки тканей и с помощью щипцов перенесите образцы тканей в закладные формы поверхностью разреза вниз. Поместите закладное кольцо на верхнюю часть формы.

Долейте в каждую формочку расплавленный парафин. Переложите формочки на холодную плиту, пока парафин не застынет. Храните парафиновые блоки в герметичном контейнере с силикагелем при температуре четыре градуса Цельсия.

Срезы вырезаются из парафиновых блоков на микротоме по стандартной методике, а для монтажа выбираются срединные срезы, включающие в себя апикальную меристему побега. Чтобы закрепить секции на предметных стеклах, поместите слайды, которые либо не содержат РНКазы, либо запечены на нагревателе слайдов при температуре 42 градуса Цельсия. Нанесите несколько капель 50% раствора этанола на каждую горку.

Аккуратно положите секции на предметное стекло и всплытие на растворе этанола до тех пор, пока они не расширятся. Далее наклоните предметное стекло и удалите излишки раствора этанола путем аспирации с помощью одноразовой передаточной пипетки. Используйте безворсовые салфетки, чтобы удалить дополнительный раствор этанола.

Сушите предметные стекла при температуре 42 градуса Цельсия в течение нескольких часов или на ночь. Когда предметные стекла высохнут, храните их в герметичном контейнере с силикагелем при температуре четыре градуса Цельсия. Депарафинизируйте предметные стекла в день микродиссекции.

Подготовьте три стеклянные банки Coplin, две банки, содержащие около 50 миллилитров 100% ксилола, и одну банку, содержащую около 50 миллилитров 100% этанола. Погрузите предметные стекла в один ксилол на две минуты, два ксилола на две минуты и 100% этанол на одну минуту. Слейте воду с предметных стекол на безворсовые салфетки и высушите на воздухе при комнатной температуре.

Чтобы начать эту процедуру, закрепите предметные стекла на предметном столике лазерного микродиссекционного микроскопа. Решающим фактором успеха лазерной микродиссекции в экспериментах РНКасики является использование морфологических и молекулярных маркеров для выбора точных доменов для микродиссекции. Изучите слайды с помощью объектива 5X и определите пять наиболее медианных секций на каждом слайде, используя вершину апикальной меристемы побега в качестве центральной точки отсчета.

Затем используйте объектив 10X или 20X, чтобы определить положение язычка на пластохронном семилистном зачатке каждого участка. Язычок будет виден в виде бугорка, выступающего из адаксиальной поверхности листа зачатка. Используйте инструмент рисования программного обеспечения для лазерной микродиссекции, чтобы отметить это положение.

Выберите значок рисования от руки, переместите курсор в нужное положение, а затем щелкните и перетащите мышь для рисования. Следующим шагом является использование линейки и инструмента для рисования прямоугольников высотой 100 микрометров с центром в слое каждого сечения в качестве образцов язычка. Чтобы использовать инструмент «Линейка», выберите значок линейки, переместите курсор на один конец измеряемой области, а затем щелкните и перетащите ее, чтобы измерить область.

Длина линейки будет отображаться на экране. С помощью линейки измерьте 100-микрометровый сегмент с центром в язычке. Чтобы нарисовать прямоугольник, выберите инструмент рисования прямых линий и нарисуйте четыре прямые линии.

Таким же образом измерьте прямоугольники размером 100 микрометров, расположенные на 50 микрометров выше и ниже прямоугольника. Это будут образцы клинка и ножен. Микрорассекайте измеренные прямоугольники с помощью функции лазерной резки, чтобы разрезать участок ткани вдоль контура выбранного домена, и функции катапульты, чтобы сдвинуть прямоугольник ткани с предметного стекла в крышку пробирки.

Соберите образцы язычка, лезвия и оболочки в отдельные пробирки. Используйте ту же процедуру для микропрепарирования лезвия, язычка и оболочки адаксиальных эпидермальных образцов из пластохронных семилистных зачатков. Наконец, нанесите буфер для экстракции РНК на микрорасчлененную ткань и приступайте к экстракции РНК, амплификации РНК, построению библиотеки, секвенированию и биоинформатическому анализу, как описано в рукописи.

При анализе накопления транскриптов и всех клеточных слоях лопасти, язычка и влагалища было обнаружено 2 359 дифференциально экспрессируемых генов. В области адаксиальной эпидермальной лопасти, язычка и влагалища было обнаружено 3 128 дифференциально экспрессируемых генов. Лазерная микродиссекция, RLM, секвенирование РНК и анализ гибридизации in situ дали последовательные результаты, как показано на примере этих репрезентативных генов.

Рисунки слева иллюстрируют ЛМ всех слоев клеток, а рисунки справа иллюстрируют ЛМ только адаксиального эпидермиса. Стрелки на изображениях указывают на зарождающиеся язычки. Накопление одного транскрипта язычков было значительно выше в язычке как во всех слоях клеток, так и в эпидермальном ЛМ. Узкая оболочка была значительно повышена в области язычка как во всех слоях клеточного слоя ЛМ, так и в адаксиальном эпидермисе ЛМ, и накапливается специфически в кончике формирующегося язычка.

Ген с неизвестной функцией имел более высокий средний показатель пересчета в эпидермальном ЛМ язычка, чем во всех слоях ЛМ. Этот транскрипт наиболее сильно накапливается в клетках эпидермиса. Четвертый ген, Zm PIN1a, не был значимо дифференциально экспрессирован при анализе всех слоев клеток, но был значительно повышен в язычке при анализе только эпидермиса. Его высокая экспрессия в сосудистой ткани могла спутать различия в накоплении транскрипта в эпидермисе при сборе всех клеточных слоев.

При проведении этой процедуры важно помнить, что выбор клеточных доменов для микропрепарирования и сравнения, а также точность микродиссекций имеют решающее значение для успеха экспериментов.