Тестирование Сосудистый инвазивным способность раковых клеток в данио рерио (

Общая цель этой процедуры — оценить злокачественное и инвазивное поведение раковых клеток в модели эмбриона рыбки данио. Этот метод помогает исследователям определить, могут ли раковые клетки проникать из функциональной системы кровообращения, тем самым моделируя ключевой этап метастатического каскада. Основное преимущество этой методики заключается в том, что модель эмбриона рыбки данио обеспечивает такую оценку и более короткое время выполнения по сравнению с аналогичными экспериментами, часто проводимыми на мышах.

Демонстрировать процедуру будет доктор Эрик Глазго, который руководит центром по выращиванию рыбок данио в Джорджтаунском университете. После подготовки раковых клеток, реагентов и эмбрионов рыбок данио в соответствии с текстовым протоколом подключите систему дозирования микроинъекций к источнику сжатого воздуха и включите источник питания. Проверьте давление, нажав на ножную педаль.

Из иглодержателя должен исходить короткий импульс воздуха. Добавьте 20 миллилитров 2X Tricaine Solution в инъекционную пластину и поместите пластину на шейкер, чтобы уравновесить ее. Затем повторите уравновешивание со второй аликвотой 2X Tricaine.

Затем с помощью пластиковой пипетки перенесите группу эмбрионов в небольшую чашку, содержащую 2X раствор трикаина. С помощью гелезагрузочного наконечника заполните иглу для микроинъекций раковыми клетками. Поместите иглу в банку для хранения электродов заостренным концом вниз, чтобы клетки расположились рядом с кончиком.

Перенесите от 20 до 30 обезболиваемых эмбрионов в инъекционную пластину, собрав эмбрионы с большим количеством трикаина 2X в пластиковую пипетку. Дайте эмбрионам застыть на кончике пипетки, затем аккуратно вытолкните эмбрионы в желоб инъекционной пластины, распределяя эмбрионы по длине желоба. Выровняйте зародыши головками вверх и животами лицом к отвесной стенке кормушки.

Прикрепите иглу к иглодержателю микроманипулятора. Затем расположите инъекционную пластину под стереоскопом стенкой под углом 60 градусов влево и сфокусируйтесь на верхнем эмбрионе с 25-кратным увеличением. Расположите микроманипулятор так, чтобы при выдвижении игла прокалывала эмбрион.

Затем вытяните иглу на глаз до тех пор, пока она почти не коснется эмбриона. Теперь, глядя под микроскопом, выровняйте иглу вверх по отношению к эмбриону. Чтобы ввести клетки, прокалывайте зародышевую кормушку через желточный мешок.

Нажмите на ножную педаль, поместив кончик прямо в пресердечную пазуху, но не внутрь нее. Сила инъекции вытолкнет клетки в сердечный синус. В качестве альтернативы, введение клеток в желточный мешок позволяет изучать различные аспекты сосудистой инвазии, как описано в рукописи.

Правой рукой вытяните и втяните иглу для инъекций. Левой рукой выполните тонкую регулировку, чтобы расположить следующий эмбрион. Когда вся пластина будет введена, верните иглу в банку для хранения электродов.

Чтобы перенести эмбрионы в чашку для восстановления, наклоните инъекционную пластину, чтобы вытащить эмбрионы на дно, вымывая все эмбрионы из кормушки и используя пластиковую пипетку для их сбора. Дайте эмбрионам осесть на дне пипетки, затем перенесите эмбрионы в чашку для восстановления в минимальном количестве трикаина. Инкубируйте чашку для восстановления при температуре 28 градусов Цельсия в течение одного часа, прежде чем отделить жизнеспособные эмбрионы от мертвых эмбрионов и мусора.

Инкубируйте блюдо при температуре 33 градуса Цельсия до готовности к забиванию. После обезболивания партии эмбрионов, подлежащих оценке, согласно текстовому протоколу, поместите обезболенную личинку на предметное стекло депрессионного микроскопа в каплю трикейна. Ориентируйте личинки латерально для оптимальной визуализации каудальной области.

Поместите предметное стекло на составной флуоресцентный микроскоп с объективом 10X. Оцените личинок, подсчитав количество раковых клеток, которые успешно вторглись из сосудистой сети, фокусируясь вверх и вниз через область хвоста, чтобы четко различить интактные клетки. Растопите 1,5%-ный раствор агарозного трикаина и доведите его до 37 градусов Цельсия.

После обезболивания эмбрионы, как и раньше, переносят эмбрион в каплю раствора Трикаина на визуализирующую поверхность. Используйте стеклянную пипетку, чтобы удалить избыток раствора трикаина, удерживая эмбрион на поверхности изображения. Затем нанесите на зародыш одну каплю расплавленного раствора агарозы.

Работая быстро, прежде чем агароза полимеризуется, используйте деликатный инструмент, такой как щетка для ресниц, чтобы ориентировать эмбрион в боковом направлении для визуализации, уделяя особое внимание тому, чтобы эмбрион был сплющен вдоль поверхности визуализации. Когда агарозная капля полимеризуется, погрузите ее в раствор Трикаина. Наконец, подвергните живой эмбрион данио-рерио микроскопической визуализации.

Из семи клеточных линий рака молочной железы, протестированных на их сосудистую инвазивную способность у эмбрионов рыбок данио, клеточная линия MDA-MB-231 показала наибольшее количество экстравазированных раковых клеток на эмбрион при оценке через 96 часов после инъекции. Также было замечено, что клетки BT-474 легко проникают в каудальную область эмбрионов, в то время как другие клеточные линии, такие как клетки MCF-7, SK-BR-3 и T-47D, были минимально инвазивными. В модифицированном эксперименте, в котором используется другой сайт инъекции, был проведен конкурентный эксперимент, в котором две популяции клеток MDA-MB-231, различающихся по своей способности к инвазивности сосудов, были одновременно введены в желточный мешок развивающихся эмбрионов.

При подсчете баллов было установлено, что клетки MDA-MB-231 размножались в условиях сливающейся культуры до инъекции, демонстрировали снижение интравазации в кровоток и, следовательно, имели сниженное присутствие в каудальной области эмбрионов. После освоения инъекции эмбрионов данио-рерио могут быть сделаны за четыре часа, если они выполнены правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о необходимости использования строгих и последовательных критериев при оценке экстравазации раковых клеток.

После этой процедуры результаты могут быть дополнительно проверены на мышиной модели. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять инъекции и оценивать экстравазацию, что позволит проверить сосудистую инвазивную способность раковых клеток у эмбрионов рыбок данио.