Метод ЧИП-экзо: Выявление белок-ДНК взаимодействий с Near пар оснований Precision

Общая цель этой функциональной геномной технологии заключается в определении точных геномных мест, которые данный белок занимает в живых клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регуляции генов и эпигенетики, например, как механизм транскрипции собирается и работает в контексте хроматина. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он выявляет точное местоположение генома для взаимодействий белковой ДНК с предварительным разрешением, близким к базовому, и исключительно низким фоном.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что протокол сложен и требует внимания к деталям на протяжении всего процесса. Чтобы обработать ядерные лизаты ультразвуком, начните с помещения адаптеров для смолы в 15-миллилитровые полистирольные трубки, содержащие ядерные экстракты. Ультразвуком обрабатывайте лизаты в ледяной водяной бане при средней мощности в течение 30 секунд включения и 30 секунд выключения, в общей сложности два сеанса по 15 минут.

Чтобы проверить результаты ультразвуковой обработки, перенесите два образца по 10 микролитров из каждой пробирки в пробирки объемом 1,5 миллилитров. Затем сшивают в обратном направлении, соединяя первый образец объемом 10 микролитров с 10 микролитрами TE-РНКазы А и 0,2 микролитрами протеиназы К. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте четыре микролитра красителя 6X ксилол ДНК.

Ко второму образцу объемом 10 микролитров сохраните поперечные связи, добавив два микролитра красителя 6X ксилола ДНК. Запустите оба образца на 1,5%-ный агарозный гель при напряжении 140 вольт в течение примерно 30-45 минут, пока бромфенольный краситель в последнем не окажется на трех четвертях пути вниз по гелю. Если ультразвуковая обработка прошла успешно, перенесите ультразвуковые лизаты в две миллилитровые пробирки, содержащие 150 микролитров 10% Triton X-100, и смешайте вортекс.

Гранулируйте нерастворимый хроматин и мусор путем вращения лизатов ультразвуком при температуре 20 000 раз больше g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем переложите надосадочную жидкость в новые двухмиллилитровые трубки. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение неопределенного времени.

Для каждой реакции иммунопреципитации хроматина или ChIP соедините 1,5 миллилитров ультразвуковых экстрактов с конъюгатами гранул антител в пробирках объемом 1,5 миллилитров. Инкубируйте трубки на мини-вращателе трубок со скоростью девять при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Через несколько минут убедитесь, что образцы не протекают и правильно перемешиваются.

На следующий день очень кратко раскрутите трубки, чтобы собрать жидкость в крышках, и поместите пробирки на магнитную решетку на одну минуту. Затем аспирируйте экстракт. Добавьте 0,75 миллилитров буфера RIPA в каждую пробирку.

Затем снимите трубки с магнитной решетки и переверните их несколько раз для перемешивания. После короткого отжима поместите трубки обратно на магнит и аспирируйте надосадочную жидкость. После последней промывки добавьте по 0,75 миллилитра 10 миллимоляра Tris HCL в каждую трубку.

Снимите пробирки с магнитного штатива и несколько раз переверните образцы для перемешивания. После короткого отжима поместите трубки обратно на штатив и аспирируйте надосадочную жидкость. После проведения реакций полировки и детализации согласно текстовому протоколу, заполните расчеты мастер-смеси лигирования.

Затем сделайте лигирование смесью в пробирке объемом 1,5 миллилитра на льду и пипеткой перемешайте раствор. Установив пробирки с образцами на магнитный штатив, добавьте 48 микролитров мастер-смеси для лигирования P7 и два микролитра с разным индексом адаптера в каждый из образцов смолы. Инкубируйте образцы в термомиксере при трехкратной g при 25 градусах Цельсия в течение двух часов.

После промывки образцов и выполнения реакции репарации Phy 29 ника и киназы в соответствии с текстовым протоколом заполните расчеты мастер-смеси лямбда-экзонуклеазы и сделайте смесь лямбда-экзонуклеазы в 1,5-миллилитровой пробирке на льду. Добавьте 50 микролитров смеси лямбда-экзонуклеазы в каждый образец смолы, еще находясь на магнитном штативе. Затем инкубируйте образцы в термомиксере при трехкратной g при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

После отсасывания последней промывки, как описано в текстовом протоколе, проведите реакцию нуклеазы RecJf, заполнив расчеты мастер-смеси RecJf и сделав смесь RecJf на льду. Добавьте 50 микролитров смеси RecJf в каждый образец смолы на магнитном штативе. Затем инкубируйте образцы в термомиксере при трехкратной g при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

После отсасывания последней промывки приготовьте буфер для элюирования ChIP и мастер-смесь протеиназы К и добавьте по 200 микролитров раствора в каждый образец смолы. Инкубируйте образцы в термомиксере при трехкратной g при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи с нагреваемой крышкой, чтобы предотвратить образование конденсата. На следующий день кратко покрутите образцы и поместите пробирки на магнитную стойку на одну минуту.

Затем переложите 200 микролитров надосадочной жидкости в новую 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую 200 микролитров TE-буфера. После экстракции ДНК, первичного удлинения P7 и реакций ATL заполните таблицу для лигирования адаптера P5 и сделайте мастер-смесь для лигирования на льду. Добавьте 20 микролитров смеси для лигирования в каждый образец и перемешайте с помощью пипетки.

Затем инкубируйте образцы в термоамплификаторе при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух часов. Проведите очистку и количественное определение ДНК в соответствии с текстовым протоколом. Как показано здесь, стоит потратить время на оптимизацию условий ультразвука для получения высококачественных экстрактов хроматина, которые дают фрагменты ДНК от 100 до 500 пар оснований.

А анализ электрофоретического сдвига подвижности используется для проверки того, что обработанные ультразвуком экстракты содержат неповрежденные белковые сшивки ДНК, что проявляется в виде суперсдвига фрагментов ДНК. Для оценки фонового сигнала обычно проводится имитация ChIP без участия антител в реакции. Высококачественная экзо-библиотека ChIP даст очень мало информации в макете образца по сравнению с подготовкой библиотеки ChIP-seq.

Здесь показана оценка библиотеки ChIP-exo с помощью биоанализатора. Анализ точно обеспечивает распределение библиотеки по размерам и обнаруживает загрязняющие димеры адаптера, работающие на 125 парах оснований. На этой панели показано гладкое распределение разделенных цепей ChIP-exo меток пяти простых N для полимеразы II, TFIIB и TBP в гене RPS12 человека в пролиферирующих клетках K562.

На этом рисунке показаны средние паттерны ChIP-exo относительно сайтов транскрипционного начала генов, кодирующих белки. Основные пиковые местоположения TBP, TFIIB и полимеразы II на композитном графике отражают геномную организацию комплексов инициации транскрипции человека. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре дня, если она выполнена правильно.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регуляции генов к изучению молекулярных деталей субъядерной структуры в ассимметрии дрожжей. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование экспрессии РНКазы, чтобы ответить на такие вопросы, как влияет ли данный фактор на экспрессию соседнего гена. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном заполнении основных таблиц смеси для всех ферментативных этапов.

Не забывайте, что работа с канцерогенами и другими едкими веществами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подготовить качественную библиотеку ChIP-exo.