Живая съемка по изучению микротрубочек динамической неустойчивости в таксанов устойчивостью рака молочной железы
20 февраля 2017 г.
В этой статье мы сообщаем о протоколе, описывающем метод in vivo для измерения динамической нестабильности микротрубочек в клетках рака молочной железы, резистентных к доцетакселу (MCF-7TXT). В этом методе используется система визуализации деконволюционной микроскопии для обнаружения экспрессии GFP-тубулина в клетках-мишенях.
Общая цель этого эксперимента — измерить динамическую нестабильность микротрубочек в клетках рака молочной железы, резистентных к доцетакселу. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии о динамической нестабильности микротрубочек в физиологических условиях и после различных лекарственных препаратов. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она обеспечивает простой, надежный и физиологически применимый протокол изучения динамики микротрубочек в живых клетках.
Перед началом процедуры вырастите клетки рака молочной железы в полной питательной среде в 10-сантиметровых чашках для культивирования при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе до соответствующей степени конфлюенции. За день до эксперимента промойте 24-миллиметровые стеклянные стекла с покрытием из поли-L-лизина 70% спиртом и подвергните их воздействию ультрафиолетового излучения на ночь. На следующее утро поместите по одному покровному листу в каждую лунку шестилуночной пластины.
Затем промойте культуры PBS, и отделите клетки в каждой чашке с 0,5 миллилитрами трипсина ЭДТА. Когда клетки начали подниматься со дна пластины, нейтрализуйте трипсин пятью миллилитрами свежей питательной среды и подсчитайте клетки. Затем добавьте примерно один раз по 10 пятых клеток к каждой крышке, осторожно встряхните пластину и верните клетки в инкубатор не менее чем на 36 часов.
Для анализа динамики микротрубочек смешивания клеток GFP мечили исходный раствор альфа-тубулина несколько раз путем инверсии, чтобы получить однородный раствор без завихрения. Затем замените питательную среду в каждой лунке двумя миллилитрами свежей среды, содержащей 40 микролитров тубулина. Осторожно встряхните пластину, чтобы обеспечить полное смешивание маркера с питательной средой, и верните планшет в инкубатор еще на 24 часа.
На следующий день замените питательную среду свежей средой, содержащей доцетаксел и верните тарелку в инкубатор на 30 минут. Пока клетки ингибируются, включите инвертированный флуоресцентный микроскоп и предварительно нагрейте держатель образца до 37 градусов Цельсия. Затем выберите объектив масляного объектива 60X 1.42 NA и установите первую защитную крышку на держатель образца.
Накройте образец одним миллилитром свежей среды, содержащей доцетаксел 37 градусов Цельсия, и найдите кластер плоских клеток с высокой интенсивностью флуоресценции альфа-тубулина, меченного GFP, с хорошо видимыми структурами микротрубочек. Сфокусируйтесь на периферийной области одной из ячеек в кластере и установите соответствующее время экспозиции в частоте получения изображения. Ровно через 50 минут после добавления первой аликвоты доцетаксела начинают записывать динамику микротрубочек в течение двух минут, получая фотографию каждые две секунды.
Когда все изображения будут получены, представьте следующую ячейку, как показано выше, до тех пор, пока не будут получены изображения пяти клеток в общей сложности из всех трех лунок с каждой концентрацией доцетаксела. Когда все изображения будут получены для каждой концентрации ингибитора, откройте программу деконволюции в системе микроскопа и щелкните мышью. Далее выберите деконволюцию и перетащите файл изображения в окно ввода.
Нажмите кнопку «Готовь», чтобы деконволютировать изображение, и откройте файл деконволюционного изображения в программном обеспечении микроскопа. Нажмите «Файл» и сохраните как фильм. Установите формат фильма AV, а стиль анимации — forward.
Установите качество сжатия на 100% и частоту кадров на пять в секунду. Затем отметьте окошко «Анимация через время» и нажмите «Сделать это», чтобы создать видео. В этом репрезентативном эксперименте нормальные и устойчивые к доцетакселу клетки рака молочной железы обрабатывались доцетакселом и визуализировались так, как только что было продемонстрировано, но влияние лечения на рост и укорочение микротрубочек наиболее очевидно в клетках, не устойчивых к доцетакселу.
Действительно, измерение скорости роста и укорочения микротрубочек в условиях лечения доцетакселом 0,5 микромоля показывает сильное ингибирование динамики тубулина родительских, но не устойчивых к доцетакселу клеток. После освоения весь процесс может быть завершен в течение 60 часов, если техники выполнены правильно. При проведении этой процедуры важно помнить о выборе плоских клеток с высокой интенсивностью флуоресценции тубулина GFP и уменьшать как интенсивность флуоресценции возбуждения, так и продолжительность воздействия, чтобы избежать затухания флуоресценции GFP.
С момента своего развития этот метод проложил путь исследователям в области клеточной биологии и биологии рака для оценки воздействия различных агентов, нацеленных на микротрубочки, на нормальные и раковые клетки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерить динамическую нестабильность микротрубочек в живых клетках в различных условиях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол измерения динамической нестабильности микротрубочек в резистентных к доцетакселу клетках рака молочной железы с помощью микроскопии с деконволюцией. Метод основан на экспрессии GFP-тубулина в живых клетках, что позволяет изучить поведение микротрубочек при воздействии препарата.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Исследования рака
- Методы микроскопии
Теоретические основы
- Микротрубочки играют важнейшую роль в структуре и функционировании клеток.
- Резистентность к доцетакселу представляет собой серьезную проблему при лечении рака молочной железы.
- Понимание динамики микротрубочек может помочь в разработке терапевтических стратегий.
- GFP-тубулин позволяет визуализировать поведение микротрубочек в режиме реального времени.
Цель исследования
- Разработать надежный метод изучения динамики микротрубочек в живых клетках.
- Исследовать влияние лекарственных препаратов на нестабильность микротрубочек.
- Углубить понимание биологии раковых клеток.
Используемые методы
- Визуализация микротрубочек in vivo с помощью микроскопии с деконволюцией.
- Культивирование резистентных к доцетакселу клеток рака молочной железы (MCF-7 TXT).
- Экспрессия GFP-тубулина для визуализации.
- Подготовка покровных стекол с поли-L-лизинным покрытием для адгезии клеток.
Основные результаты
- Успешная визуализация динамики микротрубочек в живых клетках.
- Демонстрация нестабильности микротрубочек в ответ на воздействие препарата.
- Разработка протокола, который может быть применен к различным типам клеток.
- Понимание механизмов лекарственной устойчивости в раковых клетках.
Выводы
- Данный протокол представляет собой ценный инструмент для изучения динамики микротрубочек.
- Полученные результаты способствуют пониманию поведения раковых клеток при проведении терапии.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для изучения других терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Измерение динамической нестабильности микротрубочек в живых раковых клетках представляет собой физиологически релевантный анализ для оценки механизмов резистентности к агентам, воздействующим на микротрубочки (MTA). Данный подход позволяет провести валидацию мишени, связывая поведение микротрубочек с ответом на препарат, что повышает прогностическую достоверность при доклиническом скрининге MTA. Метод способствует снижению рисков при применении терапии на основе таксанов за счет раннего выявления фенотипов резистентности на этапе поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: проверка терапевтической гипотезы путем количественного определения скорости роста и сокращения микротрубочек при воздействии доцетаксела.
- Практическая ценность: использование экспрессии тубулина с GFP-меткой в живых клетках для визуализации в режиме реального времени в физиологических условиях без артефактов фиксации.
- Прогностическая ценность: дифференциация доцетаксел-чувствительных и резистентных фенотипов на основе ингибирования динамики микротрубочек, что позволяет оценить достоверность выбора мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: устанавливает стандартизированный протокол измерения динамики микротрубочек в адгезивных клетках рака молочной железы с использованием микроскопии с деконволюцией.
- Количественные выходные данные: генерирует данные таймлапс-съемки, позволяющие измерять скорость роста и укорочения микротрубочек в качестве функциональных показателей.
- Применение для скрининга: обеспечивает оценку влияния MTA на нестабильность микротрубочек в живых клетках, что облегчает скрининг соединений или генотипов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует резистентность к таксанам в клетках рака молочной железы линии MCF-7, что отражает механизмы резистентности, наблюдаемые в клинической практике.
- Трансляционная преемственность: Связывает изменения динамики микротрубочек с вызванным доцетакселом митотическим арестом и резистентностью к апоптозу.
- Решения с учетом рисков: Позволяет на раннем этапе выявлять фенотипы резистентности, что служит основой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки программ MTA (соглашений о передаче материалов).
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки препаратов — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что особенно актуально для агентов, воздействующих на микротрубочки, где механизм резистентности связан с изменением динамики микротрубочек.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверять гипотезы о поведении микротрубочек как определяющем факторе лекарственного ответа в живых клетках.
- Скрининг: Предоставляет готовую систему анализа для количественной оценки изменений нестабильности микротрубочек после воздействия соединений или генетических пертурбаций.
- Аналитика: Обеспечивает измерение скорости роста и сокращения микротрубочек в качестве количественных временных показателей для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает измерения динамической нестабильности с функциональными результатами, такими как митотический арест и апоптоз в резистентных и чувствительных клетках.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу для визуализации, применимую к различным классам MTA и клеточным моделям, помимо резистентного к доцетакселу рака молочной железы.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени путем связывания динамики микротрубочек с фенотипом действия препарата в физиологическом контексте.
- Операционная ценность: предлагает надежный стандартизированный протокол визуализации живых клеток с минимальным набором специализированного оборудования, помимо флуоресцентной микроскопии.
- Стратегическая ценность: снижает механистическую неопределенность при резистентности к MTA, что позволяет раньше минимизировать риски и повысить эффективность использования капитала в онкологических программах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию кандидатов MTA с учетом рисков путем выявления механизмов резистентности до проведения исследований in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области прижизненной визуализации клеток, флуоресцентной микроскопии и биологии микротрубочек.
- Необходимо наличие инвертированного флуоресцентного микроскопа с иммерсионным масляным объективом, климатической камерой и программным обеспечением для деконволюции.
- Требуется стандартизация посева клеток, экспрессии GFP-тубулина и времени введения препаратов во всех экспериментах.
- Предполагает необходимость адаптации методики для различных типов клеток, маркеров микротрубочек или методов визуализации.
- Ограничено рисками фотообесцвечивания, что требует тщательного контроля интенсивности возбуждения и времени экспозиции, как указано в протоколе.
