Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

Общей целью этой процедуры является создание пролиферативных тетраплоидных клеток, свободных от диплоидной популяции, из нормальных фибробластов человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования канцерогенеза, например, как развиваются анеуплоидные клетки на ранних стадиях канцерогенеза. Основное преимущество этого метода заключается в том, что пролиферативные тетраплоидные клетки, свободные от диплоидной популяции, могут быть установлены с помощью относительно простых процедур.

В то время как некоторые штаммы становятся полностью тетраплоидными при простом лечении веретенообразным ядом, демеколцином, большинство из них необходимо обрабатывать методом стряхивания во время этого лечения, чтобы имитировать диплоидную популяцию. Чтобы начать индукцию тетраплоидии без метода стряхивания, пропустите примерно пять раз по 10 на 1/5 культивируемых клеток в 100-миллиметровую чашку. Инкубируйте блюдо в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

После этого обработайте экспоненциально растущие клетки средой, содержащей 0,1 микрограмма на миллилитр DC. Инкубируйте в атмосфере с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех дней. Затем замените ДК-содержащую среду на безнаркотическую. Инкубируйте в 5% углекислом газе при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока размножение не возобновится.

Чтобы индуцировать тетраплоидию с помощью метода стряхивания, пропустите культивируемые клетки в колбы Т-75, убедившись, что каждая колба содержит по крайней мере одну колбу от 10 до 1/6 клеток. Инкубируйте колбы в атмосфере с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день обрабатывайте клетки средой, содержащей DC, в течение 16-18 часов, чтобы остановить их в митозе, как описано в текстовом протоколе.

После инкубации проверьте клетки в колбе под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. А затем аккуратно встряхните каждую колбу, чтобы начать сбор слабо прилипших митотических клеток. Следует избегать неосторожного обращения, такого как сильная тряска или прикосновение кончиком пипетки к поверхности колбы.

Не загрязняйте митотические клетки адгезивными интерфейсными клетками. Аккуратно промойте колбы теплой средой и переложите ячейки в центрифужные пробирки. Используйте счетчик атомных ячеек для подсчета номера ячейки.

После подсчета клеток центрифугируйте при 300-кратном g в течение пяти минут. Пересейте собранные митотические клетки в 16-миллиметровые чашки для культивирования. Затем обработайте покрытые клетки средой, содержащей 0,1 мкг на миллилитр DC. Инкубируйте в 5% углекислом газе при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех дней.

После этого замените ДЦ-содержащую среду на безнаркотическую. Инкубируйте в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока распространение не возобновится. Для анализа ДНК-плоидности промойте клетки PBS.

Затем добавьте в клетки раствор, содержащий 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. Выдерживать в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После этого переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку.

А нейтрализовать трипсин можно путем добавления среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Центрифугируйте клетки в среде при 300 умноженных на г в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах PBS.

Затем снова центрифугируйте при 300-кратном g в течение пяти минут. Далее ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Добавьте четыре миллилитра 100% этанола по каплям при перемешивании.

Дайте суспензии отдохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут для фиксации ячеек. После этого центрифугируют клетки в фиксирующем растворе в 300 раз g в течение пяти минут. И ресуспендировать клетки в пяти миллилитрах PBS.

Центрифугируйте суспензию при 300 умноженных на g в течение пяти минут. Затем обработайте клетки 475 микролитрами 0,5 миллиграмм на миллилитр раствора РНК. Добавьте 25 микролитров одного миллиграмм на миллилитр раствора пропидиального йода для окрашивания клеток.

А затем перемешать. Дайте суспензии отдохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем с помощью проточного цитометра с лазером 488 нм и эмиссионным фильтром красного канала проанализируйте содержание ДНК в клетках.

Также проанализируйте эталонный образец, полученный из подлинных диплоидных клеток, чтобы оценить плоидность клеток-мишеней. Для начала обрабатывайте экспоненциально растущие клетки средой, содержащей 0,1 микрограмма на миллилитр DC в течение четырех часов, чтобы остановить клетки в метафазе. После этого соберите не менее пяти раз по 10 до 1/5 клеток методом трипсинизации.

Суспензируйте собранные клетки в среде, содержащей FBS. Центрифугируйте суспензию при 300 умноженных на g в течение пяти минут. Затем добавьте пять миллилитров 0,075 молярного раствора хлорида калия.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. После завершения инкубации центрифугируйте суспензию при 300-кратном g в течение пяти минут. Ресуспендируйте клетки в пяти миллилитрах фиксатора Карноя.

А затем центрифугировать суспензию при 300-кратном g в течение пяти минут. Затем аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 0,5 миллилитрах фиксатора Карноя. Капните 30 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло.

Наконец, окрашивайте и анализируйте клетки с помощью подсчета хромосом или анализа кариотипа. В этом исследовании пролиферативные тетраплоидные клетки, свободные от диплоидной популяции, культивируются из нормальных фибробластов человека. Хотя некоторые клеточные штаммы могут стать полностью тетраплоидными при длительном лечении ДК, большинство клеток необходимо обрабатывать методом стряхивания во время курса лечения ДК для устранения диплоидной популяции.

Здесь представлены репрезентативные результаты индукции тетраплоидии в трех штаммах фибробластов. Штамм TIG-1 становится почти полностью тетраплоидным путем простого непрерывного лечения DC.Однако это лечение приводит к тому, что штаммы BJ и TIG-hT превращаются в смесь диплоидных и четвероногих популяций. Поэтому в процессе лечения необходимо выделение митотических клеток методом стряхивания.

В установленных тетраплоидных клетках проводится подсчет хромосом. Как видно, модальное число хромосом составляет 92 для клеток TIG-1 и BJ, и 91 для клеток TIG-hT. После освоения этой техники ее можно сделать за две недели, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости осторожно встряхивать колбы на этапе стряхивания, чтобы не вызвать загрязнение митотических клеток адгезивными интерфейсными клетками.