Инжиниринг Признание Молекулярный с Био-мимических Полимеры на одностенных углеродных нанотрубках

Общая цель этой процедуры заключается в получении флуоресцентных одностенных углеродных нанотрубок ближнего инфракрасного диапазона для молекулярного зондирования, которые были функционализированы с использованием биомиметических полимеров. Эти наносенсоры могут обеспечить визуализацию живых тканей с временным разрешением. Например, их можно использовать для обнаружения дофамина в мозге.

Основным преимуществом этих датчиков является присущая им флуоресценция в ближнем инфракрасном диапазоне, которая позволяет получать изображения вглубь тканей. Синтетические сенсоры позволяют обнаруживать молекулы без элементов естественного молекулярного распознавания, что делает этот универсальный метод разработки сенсоров особенно полезным для детектирования малых молекул. Для приготовления суспензии нуклеиновых кислот из ОУНТs сначала растворяют нуклеиновые кислоты в 0,1 моляре натрия хлорида до концентрации 100 мг на миллилитр.

В вытяжном шкафу снимите статическое электричество с одноразового шпателя, микроцентрифужных пробирок и приклада SWMT с помощью антистатического пистолета. Далее добавьте 20 микролитров раствора нуклеиновой кислоты к 980 микролитрам 0,1 моляра натрия хлорида. Затем добавьте 1 миллиграмм промытых одностенных углеродных нанотрубок в полученный раствор нуклеиновой кислоты перед ультразвуковой обработкой смеси.

Расположение наконечника зонда во время ультразвуковой обработки имеет решающее значение. Если происходит вспенивание, измените положение наконечника щупа и попробуйте уменьшить амплитуду. В качестве альтернативы вы можете попробовать импульсы ультразвуковой обработки или ванны, если суспензия остается плохой.

С помощью ультразвукового аппарата с наконечником диаметром 3 миллиметра ультразвуком обрабатывайте раствор в течение 10 минут с амплитудой 40% в ледяной бане. Дважды центрифугируйте раствор ДНК SWNT в течение 90 минут при 16, 100 xg. Соберите и храните надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулы, содержащие пучки и агрегаты углеродных нанотрубок.

Утилизируйте гранулы в соответствии с институциональными процедурами обращения с опасными отходами, подходящими для наноматериалов. Измерьте поглощение раствора на глубине 632 нанометра с помощью УФ-видимого спектрофотометра, чтобы определить приблизительную концентрацию взвешенных одностенных углеродных нанотрубок в соответствии с законом Ламберта-Бира и соответствующий коэффициент разбавления. Для амфифильных полимерных суспензий сначала снимите статическое электричество с одноразового шпателя, микроцентрифужных пробирок и заготовки из одностенных углеродных нанотрубок.

В вытяжной шкаф добавьте пять мг одностенных углеродных нанотрубок к пяти миллилитрам 2%-ного раствора холата натрия. С помощью ультразвукового аппарата с наконечником диаметром шесть миллиметров обрабатывайте раствор ультразвуком в течение одного часа с амплитудой 40% в ледяной бане. Центрифугируйте образец при 150 000 xg в течение четырех часов с помощью ультрацентрифуги, прежде чем тщательно собрать надосадочную жидкость.

Затем растворите 1%-ный вес амфифильного полимера в растворе scSWNT. Затем диализируйте полимерный раствор scSWNT с помощью диализной мембраны массой 3,5 килодальтон против одного литра деионизированной воды или буфера в течение пяти дней. Меняйте воду или буфер на второй час и на четвертый.

Измерьте поглощение раствора на глубине 632 нанометра с помощью УФ-ВИД спектрофотометра, чтобы определить приблизительную концентрацию взвешенных одностенных углеродных нанотрубок. Чтобы приготовить предметные стекла с покрытием BSA-биотином, очистите предметное стекло микроскопа и покровное стекло 0,17 миллиметра деионизированной водой, а затем метанол, ацетон и окончательное промывка деионизированной водой. Создайте каналы, поместив несколько кусков двустороннего скотча на расстоянии примерно пяти миллиметров друг от друга на чистом предметном стекле микроскопа.

Запечатайте каналы, взяв длинную стеклянную крышку и прижав ее к верхней части двустороннего скотча. Обязательно отцентрируйте его на предметном стекле микроскопа так, чтобы края скольжения и стекла крышки не были заподлицо. Далее добавьте 100 микролитров стокового раствора БСА-биотина в 900 микролитров 1x Трис буфера до конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр.

Налейте 50 микролитров раствора БСА-биотина в канал, пипетируя раствор на одном конце и отводя раствор на другом конце с помощью салфетки. После инкубации раствора в течение пяти минут выполните три-пять промывок 50 микролитрами 0,1 моляра натрия хлорида. Затем разбавьте 40 микролитров пяти миллиграммов на миллилитры стокового раствора NAV в 960 микролитрах 1x Tris буфера до конечной концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр.

Налейте 50 микролитров раствора NAV в канал, пипетируя раствор на одном конце и отводя раствор на другом конце с помощью салфетки. После инкубации предметного стекла в течение двух-пяти минут выполните от трех до пяти промывок 50 микролитрами 0,1 моляра натрия хлорида. Затем разбавьте исходные растворы взвешенных одностенных углеродных нанотрубок и буфера для визуализации до концентрации от 1 до 10 мг на литр.

Влейте в канал 50 микролитров этого раствора и выдерживайте в течение пяти минут. Аккуратно смойте излишки одностенных углеродных нанотрубок с помощью 50 микролитров буфера для визуализации. Чтобы измерить обратимую реакцию ДНК-одностенных углеродных нанотрубок GT15 на допамин, сначала установите каналы с сенсорным покрытием на предметный столик флуоресцентного микроскопа.

Сфокусируйте каналы с помощью 100-кратного масляного объектива и камеры на основе арсенида индия-галлия. Затем добавьте 50 микролитров 100 микромольного раствора дофамина в фосфатно-солевой буфер в проточный канал и зарегистрируйте изменение интенсивности флуоресценции. Промойте раствор дофамина с помощью фосфатно-солевого буфера и наблюдайте за изменением флуоресценции отдельных сенсоров одностенных углеродных нанотрубок.

Для проведения скрининга луночного планшета на аналитный отклик биомиметических полимерных одностенных углеродных нанотрубок пипеткой в каждую лунку впрыскивается равный объем взвешенного датчика одностенных углеродных нанотрубок. Используйте достаточный объем, чтобы равномерно покрыть дно лунки. Затем пипетки передают аналиты из библиотеки скрининга в луночные планшеты.

Подготовьте каждый аналит в трех экземплярах, чтобы учесть потенциальные колебания интенсивности возбуждения или температуры. Повышение объектива при мониторинге спектров излучения с помощью спектрометра и матрицы арсенидов индия-галлия. Оптимальное положение объектива позволит поместить фокальную плоскость примерно в середину объема образца в лунке, который должен соответствовать максимуму по измеряемой интенсивности.

Для каждой лунки образца запишите выдержку от одной до 10 секунд, чтобы собрать спектр. Сравните спектры излучения для каждой скважины с контрольной группой, содержащей только одностенные углеродные нанотрубки без дополнительного аналита, чтобы количественно оценить флуоресцентную реакцию. Спектр поглощения сенсоров ДНК-нанотрубок GT15 показывает множественные пики, соответствующие хорошо диспергированным углеродным нанотрубкам различной хиральности.

Показана флуоресценция нанотрубок GT15 в ближнем инфракрасном диапазоне. Интересно, что интенсивность флуоресценции примерно удваивается в ответ на дофамин. На этом рисунке ближняя инфракрасная флуоресцентная микроскопия показывает одиночные сенсоры ДНК GT15 из нанотрубок, иммобилизованные на поверхности стеклянной крышки.

В дальнейшем важно протестировать сенсор для использования in vivo, например, расширить библиотеку аналитов за счет включения в нее молекулярных конкурентов, проверить линейность отклика в биологически значимом режиме концентрации, а также проверить обратимость. После освоения этот подход может быть использован для создания библиотеки различных синтетических сенсоров из молекул без известных молекулярных элементов распознавания.