Коллекция Serum- и фидерных свободной эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда для подхода бесклеточный

Общие цели данного протокола заключаются в сборе кондиционированной среды из эмбриональных стволовых клеток мыши в условиях беспитательных культур сыворотки и фидера и в характеристике биологических функций этой среды. Эта процедура дает представление об антистаресцентной активности растворимых факторов, секретируемых из эмбриональных стволовых клеток мыши, для разработки безопасного и бесклеточного терапевтического подхода к возрастным заболеваниям. Демонстрировать эту процедуру будет доктор Юн-Уи Бэ, научный сотрудник моей лаборатории.

В биологической защитной капюшоне обрабатывайте эмбриональный фибробласт мыши или культуру клеток MEF 20 миллилитрами среды MEF с добавлением митомицина C в 15-сантиметровой чашке для клеточной культуры в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. В конце инкубации трижды промойте клетки PBS и отделите их тремя миллилитрами трипсина ЭДТА на три минуты при температуре 37 градусов Цельсия. Нейтрализация трипсина шестью миллилитрами свежей среды MEF, когда клетки поднялись со дна пластины.

После сбора клеток центрифугированием повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах среды MEF и планшете два раза по 10 до шестой инактивированных MEFs на 10-сантиметровую культуральную чашку в свежей среде MEF. Культивируйте питающие клетки в течение 24 часов. Затем замените среду MEF средой для эмбриональных стволовых клеток мыши и засейте эмбриональные стволовые клетки мыши два раза по 10-шестую в кормушки в течение не менее 48 часов совместного культивирования.

В капюшоне с биологической защитой промойте пластину с эмбриональными стволовыми клетками мыши пятью миллилитрами PBS и отделите клетки трипсином плюс ЭДТА, как показано выше. После сбора клеток центрифугированием повторно суспендируйте гранулу стволовых клеток в пяти миллилитрах свежей среды для стволовых клеток и поместите по одному миллилитру клеток на чашку в среду из свежих эмбриональных стволовых клеток на пять посудин для клеточных культур, покрытых желатином. Верните клетки в инкубатор до тех пор, пока культуры не достигнут 80-85% конфлюенции.

Затем промойте клетки в количестве, по крайней мере, восьми миллилитров PBS на тарелку в течение трех 10-минутных промываний с последующим 24-часовым инкубированием в среде с уменьшенным содержанием сыворотки. Не более чем через 24 часа переложите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования. Затем следует фильтрация через ситечко на крышке бутылки 0,2 микрометра.

Чтобы проверить эффекты кондиционированной среды эмбриональных стволовых клеток с помощью анализа бета-галактозидазы, связанного со старением, засейте дермальные фибробласты человека в шестилуночной пластине в среду дермальных фибробластов человека. После ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа замените половину среды свежей средой, кондиционированной эмбриональными стволовыми клетками мыши, еще на 72 часа. На третий день культивирования промойте клетки в двух миллилитрах PBS на лунку в течение двух 30-секундных промывок.

Затем зафиксируйте клетки в 3,7% параформальдегиде на пять минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу. После фиксации промойте клетки два раза двумя миллилитрами PBS, как только что было продемонстрировано, и пометьте клетки одним-двумя миллилитрами раствора SA beta gal в течение 17 с половиной часов при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа. По окончании периода окрашивания промойте клетки два раза PBS, как показано на рисунке.

Затем запятнайте Эосеном в течение пяти минут при комнатной температуре. После еще одной серии промываний PBS визуализируйте клетки с 100-кратным увеличением с помощью световой микроскопии. Для анализа клеточного цикла засейте восемь раз по 10 до четвертого человека дермального фибробласта человека в лунку в шестисантиметровую чашку для клеточной культуры в свежую среду дермальных фибробластов человека для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе.

На следующее утро замените половину среды кондиционированной средой для эмбриональных стволовых клеток мыши и верните клетки в инкубатор. Через 24 часа соберите клетки путем диссоциации трипсина ЭДТА с последующим двумя промывками в одном миллилитре раствора PBS. Повторно суспендируйте гранулу в 100 микролитрах холодного раствора PBS после второй стирки.

Затем зафиксируйте клетки с помощью капельного нанесения на 200 микролитров холодного этанола во время вортекса. Храните клетки при температуре четыре градуса Цельсия не менее часа. Затем промойте их в свежем растворе PBS.

После второго центрифугирования обработайте гранулу 250 микролитрами буфера цитрата натрия с добавлением РНКазы в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа. В конце инкубации пометьте клетки 250 микролитрами буфера цитрата натрия, содержащего йодид пропидия, на 20 минут. Затем оцените стадии клеточного цикла каждого образца с помощью проточной цитометрии.

Для количественного ПЦР-анализа с обратной транскриптазой используйте набор для экстракции РНК для выделения общей РНК из кондиционированной среды эмбриональных стволовых клеток мыши, обработанных дермальными фибробластами человека, в соответствии с протоколом производителя. Используйте спектрофотометр для количественного определения общего количества экстрагированной РНК. Затем готовят реакционную смесь, содержащую олигодезокситимидиновые праймеры и обратную транскриптазу M-MLV в соответствии с протоколом производителя.

Затем добавьте один микрограмм общей РНК в ПЦР-пробирку, содержащую реакционную смесь. Наконец, измерьте амплификацию CDNA с помощью ПЦР-машины в реальном времени с использованием зеленой мастер-смеси для ПЦР и соответствующих генных праймеров. Эмбриональные стволовые клетки мыши, выращенные в нормальных условиях культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши на слое питающих клеток MEF, имеют овальную форму и блестящий вид.

В то время как эмбриональные стволовые клетки мыши, выращенные в условиях беспитательных культур и сыворотки и фидера, демонстрируют уплощенную и нерегулярную морфологию. Лечение стареющего дермального фибробласта человека кондиционированной средой из эмбриональных стволовых клеток мыши уменьшает количество сенесцентно-ассоциированных бетагалактозидазных положительных клеток. Кроме того, анализ клеточного цикла этих клеток показывает, что обработка эмбриональными стволовыми клетками мыши кондиционированной средой резко увеличивает количество клеток в фазах S и G2/M при одновременном уменьшении числа клеток в фазе G0/G1.

Кроме того, обработка эмбриональными стволовыми клетками мыши кондиционированной средой снижает экспрессию генов, ассоциированных со старением, и цитокинов-секретарей, связанных с фенотипом старения. При попытке проведения этой процедуры очень важно помнить о сборе сыворотки и питательной среды через 24 часа, так как длительная инкубация увеличивает вероятность аутолиза или апоптоза клеток путем голодания. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как собирать сыворотку и питательную среду для кондиционирования эмбриональных стволовых клеток мыши без питательных веществ для бесклеточного подхода.

Не забывайте, что работа с реагентом, таким как параформальдегид, может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как обращение с этим реагентом в вытяжном шкафу.