Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

Общими целями данной процедуры являются выделение и характеристика нетрадиционной популяции внутриэпителиальных клеток — γδ T-клеток из образца цервикального браша человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о понимании иммунных событий в внутриэпителиальном компартменте эндоцервикса, что поможет в разработке эффективных стратегий по предотвращению инфекций. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой мощный и эффективный инструмент для изучения внутриэпителиальных γδ T-лимфоцитов эндоцервикса in vitro.

Процедуру продемонстрирует Лаура Ромеро, старший научный сотрудник моей лаборатории. Сразу после сбора поместите пробирку с цитощеткой на лед. В течение одного часа после сбора подвергните пробирку с цитощеткой перемешиванию на вортексе в четыре пульса по 10 секунд.

Затем центрифугируйте пробирку и осторожно извлеките щетку, не нарушая целостность осадка. Далее добавьте к клеткам 1 мл среды IMDM и поместите пробирку на лед. Поместите цитощетку на 100-мм клеточный фильтр-сепаратор, установленный в коническую пробирку объемом 50 мл, и промойте щетку 20 мл свежей среды IMDM.

Центрифугируйте промывочную фракцию. Ресуспендируйте осадок в 1 mL свежей среды IMDM и объедините его с промывочной фракцией и клетками в исходной пробирке для сбора цитощеткой. Для анализа эндоцервикальных клеток методом проточной цитометрии распределите по 1–3 × 10⁵ клеток в 100 µL FACS-буфера в пробирки объемом 5 mL, затем окрасьте клетки соответствующими антителами и красителем для определения жизнеспособности в течение 30 минут при 4 °C в темноте.

По окончании инкубации промойте клетки в одном миллилитре буфера из набора. После центрифугирования клеток полностью слейте супернатант. Используйте бусины и соответствующие контрольные антитела IgG для настройки компенсации.

Затем загрузите первую пробирку и установите гейт на общую популяцию эндоцервикальных клеток на диаграмме рассеяния (forward vs side scatter), после чего исключите дублеты клеток. Исключите мертвые клетки по экспрессии красителя жизнеспособности, установив гейт на живые CD45-положительные и CD3-положительные клетки. Клетки gamma delta one и gamma delta two положительные определяются как субпопуляции CD3-положительных клеток, экспрессирующих gamma delta TCR.

Для выделения γδ-T-клеток с помощью магнитных частиц ресуспендируйте до 1×10⁷ свежесобранных клеток эндоцервикса в 40 µL буфера из набора TCR gamma delta MicroBead. Следуя инструкциям производителя для двухэтапного протокола окрашивания, пометьте клетки антителами к TCR γδ с гаптеном, затем добавьте конъюгированные с FITC анти-гаптеновые микросферы (MicroBeads) на 15 минут при температуре от 4 до 8 °C. По окончании инкубации промойте клетки в 1 мЛ буфера из набора и полностью слейте супернатант.

Ресуспендируйте клетки в 500 microliters буфера из набора и нанесите клеточную суспензию непосредственно на колонку с магнитными частицами, установленную в соответствующий сепаратор-магнит, собирая прошедшую фракцию в новую пробирку. Когда все клетки пройдут через колонку, промойте её трижды 500 microliters свежего буфера и объедините промывки с собранными клетками. Для сбора γδ Т-клеток перенесите колонку в коническую пробирку и с помощью поршня колонки вымойте Т-клетки из колонки, используя один milliliter свежего буфера.

Для выделения γδ T-клеток методом сортировки клеток с помощью флуоресцентно-активированного сепарирования пометьте клетки красителем жизнеспособности в составе панели антител, как было показано ранее. Затем отсортируйте клетки по признакам жизнеспособности, а также положительной экспрессии CD45, CD3 и γδ. Уникальную популяцию γδ V1-экспрессирующих T-клеток можно легко обнаружить в образцах клеток эндоцервикса человека.

Детальный фенотипический анализ отобранных CD3-положительных gamma delta 1-положительных клеток показывает, что большинство из этих клеток являются CD4- и CD8-отрицательными. Магнитная сепарация клеток эндоцервикса, продемонстрированная выше, позволяет очистить популяцию этих TCR gamma delta клеток с чистотой почти 98%. Такой уровень чистоты может быть также достигнут с помощью сортировки клеток с флуоресцентной активацией, что подтверждает возможность использования любого из этих методов для изоляции gamma delta T-клеток эндоцервикса.

Интересно, что анализ внутриэпителиальных клеток эндоцервикса, а именно γδ T-клеток, полученных от женщин-пациенток с ВИЧ-инфекцией и здоровых доноров (контрольной группы), демонстрирует небольшое снижение количества и жизнеспособности этих важных клеток у лиц с ВИЧ-инфекцией. После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает от двух до трех часов. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости быстрой обработки образца и содержания клеток на льду на протяжении всего процесса для поддержания высокой жизнеспособности клеток.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как сортировка единичных клеток в сочетании с высокочувствительной многоканальной ПЦР с высокой пропускной способностью, чтобы получить ответы на дополнительные вопросы о воспалительных и сигнальных путях внутри внутриэпителиального компартмента эндоцервикса. После своей разработки эта методика открыла исследователям в области ВИЧ и инфекционных заболеваний путь к поиску новых клеточных маркеров слизистой уязвимости. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать внутриэпителиальные лимфоциты из образца, полученного при взятии мазка из эндоцервикса человека.