Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и характеристике нетрадиционной популяции интраэпителиальных клеток, гамма-дельта Т-клеток из образца эндоцервикальной щетки человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в понимании иммунных событий в эндоцервикальном интраэпителиальном компартменте, чтобы помочь в разработке эффективных стратегий профилактики инфекций. Основным преимуществом этой методики является то, что она обеспечивает мощный и эффективный инструмент для изучения эндоцервикальных интраэпителиальных гамма-дельта Т-лимфоцитов in vitro.

Демонстрировать процедуру будет Лаура Ромеро, старший научный сотрудник моей лаборатории. Сразу после сбора поместите пробирку с цитощеткой на лед. В течение одного часа после сбора пробирку, содержащую цитощетку, проведут четыре импульса по 10 секунд.

Затем центрифугируйте пробирку и осторожно снимите кисть, не нарушая палитру. Далее добавьте в ячейки один миллилитр среды IMDM, и поместите трубку на лед. Поместите цитощетку поверх 100-миллиметрового клеточного фильтра в конической пробирке объемом 50 миллилитров и промойте щетку 20 миллилитрами свежего IMDM.

Центрифугируйте для стирки. Суспендируя палитру в одном миллилитре свежего ИМДМ, и бассейн с промывкой с клетками в оригинальной цитощетке собираем пробирку. Чтобы проанализировать эндоцервикальные клетки с помощью проточной цитометрии, аликвот от одного до трех умножить на 10-5 клеток в 100 микролитров факс-буфера на пятимиллилитровую трубку и пометить клетки антителами и жизнеспособным красителем в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия в темноте.

По окончании инкубации промойте клетки в одном миллилитре буфера набора. После раскрутки ячеек полностью сцедите надосадочную жидкость. Используйте гранулы и соответствующие антитела контроля IgG для настройки контроля компенсации.

Затем загрузите первую пробирку и установите ворота на общую популяцию эндоцервикальных клеток на диаграмме рассеяния вперед-о-о-о, после чего исключите дублеты клеток. Исключите мертвые клетки в соответствии с их жизнеспособностью с помощью экспрессии красителя, гейтируя живые CD45-положительные и CD3-положительные клетки. Гамма-дельта 1 и гамма-дельта 2 положительные клетки определяются как субпопуляции CD3-положительных клеток, экспрессирующих гамма-дельту TCR.

Чтобы изолировать гамма-дельта Т-клетки с помощью магнитного выделения, ресуспендируйте до одного раза 10 до седьмого только что собранных эндоцервикальных клеток в 40 микролитрах буфера набора TCR gamma delta MicroBead. Следуя инструкциям производителя по протоколу двухступенчатого окрашивания, пометьте клетки анти-TCR гамма-дельта-гаптен-антителами, а затем антигаптен-конъюгированными микрогранулами FITC в течение 15 минут при температуре от четырех до восьми градусов Цельсия. По окончании инкубации промойте клетки в одном миллилитре буфера набора, и полностью сцедите надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера и нанесите суспензию на магнитную колонку, установленную в соответствующем магните-сепараторе, собирая проточные частицы в новую пробирку. Когда все ячейки пройдут через колонку, промойте колонку три раза 500 микролитрами свежего буфера и объедините промывки с собранными ячейками. Чтобы собрать гамма-дельта Т-клетки, перенесите колонку в коническую трубку и с помощью поршня колонки промойте Т-клетки из колонки одним миллилитром свежего буфера.

Чтобы изолировать гамма-дельта Т-клетки с помощью сортировки клеток, активированных флуоресценцией, пометьте клетки красителем жизнеспособности на панели антител, как показано выше. Затем отсортируйте клетки в соответствии с их жизнеспособным красителем, а также CD45, CD3 и гамма-дельта-позитивностью. Уникальная популяция гамма-дельта V1, экспрессирующих Т-клетки, может быть легко обнаружена в образцах эндоцервикальных клеток человека.

Детальный фенотипический анализ закрытых CD3-положительных гамма-дельта-позитивных клеток показывает, что большинство этих клеток являются CD4 и CD8-отрицательными. Разделение эндоцервикальных клеток магнитными шариками, как только что продемонстрировано, приводит к очищению почти 98% чистой популяции этих гамма-дельта-клеток TCR. Этот уровень чистоты также может быть достигнут с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток, что подтверждает использование любого из методов для выделения эндоцервикальных гамма-дельта Т-клеток.

Интересно, что анализ эндоцервикальных интраэпителиальных клеток, гамма-дельта Т-клеток, собранных у ВИЧ-инфицированных женщин и здоровых доноров контрольной группы, демонстрирует небольшое снижение количества и жизнеспособности этих важных клеток у ВИЧ-инфицированных лиц. После освоения эта техника может быть выполнена за два-три часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости быстрой обработки образца и держать клетки на льду на протяжении всей процедуры, чтобы поддерживать хорошую жизнеспособность клеток.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сортировка одиночных клеток в сочетании с высокочувствительной мультиплексной ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы о воспалительных и сигнальных путях в эндоцервикальном интраэпителиальном компартменте. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области ВИЧ и инфекционных заболеваний к изучению новых клеточных маркеров уязвимости слизистых оболочек. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать внутриэпителиальные лимфоциты из образца эндоцервикальной щетки человека.