На месте Выявление и количественная оценка одноклеточного наночастиц оксидов металлов, с использованием ядерных рентгенофлуоресцентного анализа

Наночастицы все чаще используются в промышленности и медицине благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам. Тем не менее, опасения по поводу здоровья человека, связанные с длительным воздействием наночастиц, сохраняются. Эти риски могут быть количественно оценены путем изучения поведения наночастиц внутри клеток и индуцированных метаболических реакций клеток на наночастицы.

Отчасти это связано с отсутствием методов, позволяющих обнаруживать и количественно оценивать интернализованные наночастицы в синклеточной клетке. В то время как многочисленные аналитические инструменты, включая микроскопию и масс-спектрометрию, могут быть использованы для оценки поглощения наночастиц клетками, они предоставляют качественную информацию только на микроскопическом уровне. Напротив, методы in situ, основанные на атомной спектроскопии, могут уменьшить количество артефактов визуализации, возникающих при подготовке образцов, и обеспечить прямое наблюдение наночастиц.

Чтобы воспользоваться этим, мы представляем корреляционный подход, который позволяет нам изучать наночастицы либо в нативном состоянии, либо в лабораторной среде с флуоресцентной меткой. В данной статье мы описываем метод, основанный на сочетании флуоресцентной микроскопии и ядерного микрозондового анализа. Это позволяет получить изображения плотности клеток, особого распределения химических элементов и количества наночастиц в клетке.

В качестве демонстрации мы проведем исследования на клетках, подвергшихся воздействию наночастиц диоксида титана в течение 24 часов, с использованием флуоресцентной микроскопии и ядерного микрозондового анализа. Для этого протокола необходим специальный держатель образца, изготовленный из полимера PEEK. Он должен быть пригоден для культивирования клеток и наблюдений in vitro.

Накройте держатель поликарбонатной пленкой толщиной два микрона. Поликарбонатная пленка приклеивается к блюду из ПЭЭК тонким слоем раствора Формвара. После установки держатель образца необходимо простерилизовать.

Несколько стерильных держателей образцов могут храниться, по одному на лунку, в стерильном двенадцатилуночном планшете до тех пор, пока они не понадобятся для использования. Клетки, трансфицированные матричными рядами GFP-плазмид, проверяются с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы убедиться, что трансфекция прошла успешно и что они экспрессируют флуоресцентный белок. Соберите клетки с трипсином и инкубируйте их в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Остановите действие трипсина, добавив свежую питательную среду. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение пяти минут со скоростью 1200 оборотов в минуту при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и добавьте соответствующий объем свежей питательной среды.

Подсчитывают клетки и проводят разведение свежей и термостатированной полной питательной средой до получения клеточной суспензии 500 клеток на микролитр. Налейте каплю объемом 40 микролитров в центр поликарбонатной фольги. Осторожно поместите образец в клеточный инкубатор на два часа.

Аккуратно добавьте два миллилитра свежей питательной среды и оставьте их на 24 часа. Флуоресцентные димодифицированные наночастицы оксида титана были разработаны, синтезированы и привиты с широко используемыми флуорофорами с целью обнаружения, отслеживания и локализации наночастиц in vitro. Для этого этапа уже должна быть приготовлена суспензия наночастиц диоксида титана в сверхчистой воде с концентрацией один миллиграмм на миллилитр.

Диспергируйте наночастицы с помощью одноминутных интенсивных импульсов ультразвука при комнатной температуре. Разведите наночастицы в соответствующей питательной среде для получения экспозиционной суспензии в четыре микрограмма на квадратный сантиметр. Переключите предыдущую среду для клеточной культуры на новую среду, содержащую наночастицы, и аккуратно перемешайте ее, чтобы добиться однородного распределения наночастиц.

Таким же образом подготовьте набор контрольных ячеек без добавления наночастиц диоксида титана. Инкубируйте клеточные популяции в течение 24 часов. Используя параформальдегид, эти образцы могут быть зафиксированы и обработаны для визуализации in situ и отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Однако криогенная физическая фиксация сохраняет ультраструктуру и биохимическую целостность клетки. Врезная заморозка быстро останавливает клеточную активность в течение миллисекунд и позволяет избежать использования фиксирующих соединений. Чтобы криогенно зафиксировать клетки, мы выполняем следующее.

Подготовьте алюминиевую передаточную пластину, охладив ее в жидком азоте. Храните пластину в коробке, наполненной жидким азотом, удерживая поверхность пластины над жидкостью в холодных парах азота. Охладите достаточное количество 2-метилбутана до 150 градусов Цельсия.

Приготовьте одного 50 миллилитрового Falcon с питательной средой и двух Falcon с ультрачистой водой. Убедитесь, что поблизости находится впитывающая бумага, чтобы высушить образец перед его замораживанием. Промойте клетки один раз в питательной среде, а затем еще два раза в стерильной, сверхчистой воде для удаления избытка солей, оставшихся в питательной среде.

Быстро высушите образец на впитывающей бумаге. Погрузите элементы в охлажденный 2-метилбутан на 30 секунд и поместите их на охлажденную алюминиевую передаточную пластину. Очень важно, чтобы коробка была максимально закрыта, чтобы предотвратить конденсацию водяного пара на поверхности холодной пластины.

После замораживания всех образцов сублимационная сушка выполняется следующим методом для сублимации воды. Во-первых, проведите первичное высыхание в течение 12-24 часов при низком давлении и низкой температуре. Затем, поддерживая низкое давление, выполните вторичную фазу высыхания в течение не менее 24 часов при повышении температуры пластины до 40 градусов Цельсия.

После криофиксации образцы могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких дней в стерильных и сухих условиях, защищенных от пыли и влаги. Анализ ядерных микрозондов проводился на объекте Ifera в Бордо, Франция. Однотронный ускоритель частиц с напряжением 3,5 мегавольт подает световой ионный пучок в диапазоне мегаэлектронвольт.

Визуализация химических элементов проводилась на микрозондовой линии пучка с использованием методов анализа дополнительных ионных пучков. Методы, используемые с помощью микро-PIXE, рентгеновского излучения, индуцированного частицами, STIM, сканирующей просвечивающей ионной микроскопии и микро-RBS, спектрометрии обратного рассеяния Резерфорда. Образцы помещаются внутри аналитической камеры и облучаются в вакууме различными частицами для выполнения различных ионно-лучевых анализов.

STIM используется для записи аэрофотокарт плотности ячеек на основе потерь энергии частиц, проходящих через области ячеек с разной плотностью. Анализ Micro-PIXE и micro-RBS обеспечивает пространственное распределение и количественную оценку химических элементов на уровне отдельных клеток. Протонный микропучок с яркостью 1,5 мегаэлектронвольта фокусируется на диаметре около 1 микрометра и сканируется на интересующих клетках, идентифицированных с помощью STIM.

Рентгеновские лучи, испускаемые атомами, присутствующими в образце, от натрия до титана, позволяют определить концентрацию элементов. Обратно рассеянные протоны собираются для того, чтобы измерить общее количество входящих частиц, необходимое для нормализации интенсивности рентгеновского излучения. Крайне важно иметь сертифицированные калибровочные стандарты для количественной оценки концентраций элементов, чтобы откалибровать отклик рентгеновского детектора.

Для анализа данных ионного пучка мы разработали новый плагин для ImageJ. Во-первых, были рассчитаны карты плотности STIM. Контраст на сканирующих просвечивающих изображениях микроскопии железа обусловлен локальными различиями в плотности и позволяет обнаруживать клеточные структуры, такие как ядро и цитоплазма.

Одновременно может быть обработано несколько карт. Каждая карта соответствует среде, передаваемой энергией от входящих частиц. Второй шаг в анализе данных заключается в вычислении спектров отдельных ячеек.

С помощью рентгеноструктурного эмиссионного анализа можно получить как химический состав образца, так и элементные карты химических элементов. Карты химических элементов вычисляются после сортировки фотонов в соответствии с положением луча в момент записи и выбора энергетического окна, центрированного вокруг определенного элемента. Карты обычно представляют собой количество обнаруженных событий в положении луча и содержат количественные данные.

Вычисляется стек химических карт, по одной для каждого выбранного элемента. Области интереса для каждой клетки находят с помощью данных PIXE для фосфора. Спектры, соответствующие каждой целой ячейке, затем рассчитываются путем суммирования отдельных спектров по интересующей области каждой ячейки.

Отсюда можно извлечь количественные данные о распространенности химических веществ в каждой клетке с помощью специального программного обеспечения для анализа PIXE и IBS. Здесь мы показываем флуоресцентную визуализацию клеток после фиксации параформальдегида. В верхнем ряду показаны клетки, которые не подвергались воздействию наночастиц диоксида титана, в то время как в нижнем ряду они подвергались.

Синий канал показывает ядро клетки, зеленый канал показывает митохондрии, а красный канал показывает титан. Хорошо видно, что в органах управления отсутствует диоксид титана. Из объединенного канала справа видно, что наночастицы находятся исключительно в цитоплазме и исключены из митохондрий.

Однако в этом методе отсутствует количественная информация о концентрации наночастиц. Анализ ядерных микрозондов может обеспечить это. Все эти изображения были получены с использованием различных методов анализа микрозондов.

Опять же, в верхнем ряду показаны контрольные ячейки, а в нижнем — клетки, содержащие наночастицы титана. На крайнем левом изображении показаны измерения плотности криогенных фиксированных клеток с помощью STIM. Следующие три панели показывают обилие калия, фосфора и титана, присутствующих в клетках, полученных с помощью PIXE.

Опять же, титан не виден ни в контрольной группе, ни в клеточных ядрах. Чтобы количественно оценить поглощение титана, ячейка за ячейкой, мы определяем интересующие нас области на основе границ ячеек, показанных на крайней правой панели, и измеряем содержание элементов в этих областях. На основе этих измерений PIXE мы построили график распределения содержания элементов на уровне отдельных клеток для контрольной и облученной популяций.

Контрольная популяция отображается белым цветом, а подверженная воздействию популяция – желтым. Среднее содержание титана, присутствующего здесь, довольно низкое по сравнению с дозой воздействия в четыре микрограмма на квадратный сантиметр. Диапазон потребления титана показывает большие колебания среди населения: от 0,2 микрограмма на квадратный сантиметр до 1,8 микрограмма на квадратный сантиметр.

Мы также заметили увеличение свободных внутриклеточных ионов, таких как калий и кальций, в образцах, подвергшихся воздействию наночастиц, что свидетельствует об изменении клеточного гомеостаза, вызванном присутствием наночастиц диоксида титана. Ядерный микрозондовый анализ может предоставить полезную информацию на субклеточном уровне и обеспечить количественную оценку химических элементов, входящих в состав биологического образца. Эти методы имеют много преимуществ.

Первая, в пробоподготовке, не требующей химической фиксации. Во-вторых, возможность изучения более крупных территорий с возможностью сосредоточиться на дополнительных областях интересов. В-третьих, количественное определение химических элементов с точностью до нескольких микрограммов на грамм.

И в-четвертых, идентификация клеточных компартментов, таких как ядро, ядрышко и цитоплазма. Точное их определение при изучении интернализации наночастиц в отдельных клетках имеет важное значение для количественной токсикологии наночастиц. Как показано в рассмотренных здесь случаях, возможность наблюдения и количественного определения наночастиц в отдельных клетках позволяет нам лучше понять накопление ценности эндогенных и экзогенных химических элементов, таких как наночастицы оксидов металлов.

Этот протокол подчеркивает пригодность анализа ядерных микрозондов для будущих исследований взаимодействия наночастиц с живыми клетками. Количественный подход дает информацию о влиянии этих наночастиц с точки зрения обнаружения, идентификации, локализации и количественной оценки, а также на уровне отдельных клеток как для нативных, так и для химически модифицированных наночастиц.