Визуализации Металлы в ткани головного мозга методом лазерной абляции - индуктивно связанной плазмы - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS)
22 января 2017 г.
Количественно отображение металлов в ткани методом лазерной абляции - с индуктивно связанной плазмой - масс-спектрометрии (LA-ICP-MS) является чувствительным аналитический метод, который может обеспечить новое понимание того, как металлы участвуют в нормальной функции и болезни процессов. Здесь мы опишем протокол для количественной визуализации металлов в тонких срезов мышиного неврологического ткани.
Общая цель данного метода заключается в количественном определении пространственного распределения металлов в срезах тканей с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и лазерной абляцией. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы как фундаментальной биологии, так и исследований заболеваний, особенно в тех случаях, когда биохимия металлов участвует в патологии заболевания. Главным преимуществом данной методики является сохранение пространственной информации о металлах, которая традиционно теряется при использовании стандартных методов анализа металлов.
Значение данного метода распространяется на терапию и диагностику нейродегенеративных заболеваний, поскольку он позволяет отслеживать изменения содержания металлов в областях мозга, в которых наблюдается гибель клеток. Как правило, люди, впервые знакомящиеся с этим методом, могут испытывать трудности при подготовке этих длительных и сложных экспериментов. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как планирование эксперимента и анализ данных могут быть затруднительны, поскольку каждый этап должен выполняться в строго определенной последовательности.
Сначала поместите образец ткани мозга и все матрично-согласованные стандарты ткани в камеру лазерной абляции. Убедитесь, что образцы находятся в пределах глубины резкости камеры LACCD. Закройте дверь камеры и затяните винты пальцами.
Затем в программном обеспечении ICPMS откройте клапан газа-носителя и установите скорость потока на 1.2 liters per minute. В программном обеспечении LA выполните 30-минутную продувку абляционной ячейки газом-носителем. Для абляционной ячейки с двойным объемом каждые десять минут перемещайте предметный столик в каждый угол камеры, чтобы уменьшить количество остаточного воздуха в ячейке.
Включите ICPMS и дайте прибору прогреться в течение двух часов. Пока прибор прогревается, в программном обеспечении для лазерной абляции нарисуйте линию абляции длиной примерно три миллиметра на поверхности первого стандартного образца ткани. Нажмите на линию абляции и установите диаметр луча по умолчанию, скорость сканирования и плотность энергии излучения.
Дублируйте линию шесть раз, располагая их на расстоянии одного диаметра луча друг от друга. Повторите этот процесс для каждого стандарта. Затем с помощью инструмента «Линия» начертите область абляции над образцом, начиная от верхнего левого угла и проходя через самую широкую часть образца, используя те же параметры, что и для стандартов.
Повторите линию столько раз, сколько необходимо для полного покрытия образца, соблюдая тот же интервал, что и для стандартов. Затем начертите набор линий для периодического сканирования стандартов не позднее чем через 20 часов после сканирования образца или между каждым образцом. Добавьте сканирование стандартов в конец эксперимента.
Исходя из длины линии и скорости сканирования, определите время анализа для линий образца и стандарта. Затем создайте новую серию в программном обеспечении ICPMS и выберите анализ с временным разрешением. Выберите интересующие значения отношения массы к заряду и установите время интегрирования для каждого отношения таким образом, чтобы общее время интегрирования за один цикл составляло 0.25 seconds.
Сохраните пакет. Для стандартного пакета укажите время анализа для каждой строки, добавив дополнительные 15 секунд в качестве буфера для учета времени прогрева лазера и промывки. Создайте список запуска образцов с сеансом сбора данных для каждой стандартной линии.
Для партии образцов продублируйте стандартную партию и соответствующим образом скорректируйте время и количество циклов сбора данных для схемы абляции образца. После прогрева ICPMS добавьте первую партию в очередь и убедитесь, что программное обеспечение ожидает сигнала запуска от прибора LA. Затем в программном обеспечении LA включите блок питания лазера и установите время прогрева и промывки лазера.
Запустите последовательность работы лазера и убедитесь, что ИСП-МС корректно начинает сбор данных после абляции. После сбора данных извлеките значения для стандартов из CSV-файлов. Выполните построение базовых линий и исключите фоновый сигнал.
Выявите падения сигнала, вызванные отверстиями в стандартных образцах тканей. Замаскируйте эти области с низким сигналом, после чего экспортируйте данные в виде электронной таблицы. Рассчитайте коэффициент пересчета из CPS в PPM для каждого определенного элемента.
Повторите этот процесс для каждого стандарта. Затем откройте программное обеспечение для количественного анализа изображений и импортируйте данные образцов из CSV-файлов. Выберите несколько областей фона для проведения коррекции фона.
Выберите инструмент редактирования графиков, щелкните правой кнопкой мыши по изображению и выберите «modify image appearance» (изменить внешний вид изображения). Установите первый цвет в положении Z на большое отрицательное значение и нажмите «done» (готово), чтобы усилить фоновый сигнал. Затем во вкладке стандартов введите поправочные коэффициенты CPS PPM для каждого стандарта и нажмите «go» (пуск).
Откройте браузер данных на вкладке данных, нажмите правой кнопкой мыши на исправленный файл изображения и выберите «new image» (новое изображение). Откройте окно изменения внешнего вида изображения («modify image appearance») и настройте цветовую таблицу и масштаб. Используйте инструмент добавления аннотаций, чтобы разместить на изображении цветовую шкалу.
Отрегулируйте цветовую шкалу в окне цветовой шкалы. После того как изображение было раскрашено и аннотировано, скопируйте и вставьте изображение в другую программу или экспортируйте его из программного обеспечения для построения изображений. Чтобы активировать инструменты ROI, выберите «обработку изображений» (image processing) в пакетах анализа и выберите изображение.
На вкладке Image нажмите ROI и выберите start ROI draw. Выделите интересующую область, затем нажмите finish ROI. На вкладке Image нажмите stats, чтобы получить данные по ROI.
Скопируйте и вставьте данные в таблицу, не забывая сохранять изменения после добавления каждого ROI. Повторяйте этот процесс по мере необходимости. С помощью данного метода было исследовано содержание и распределение металлов в головном мозге мыши дикого типа.
Здесь распределение углерода, магния и фосфора представлено в единицах отсчетов в секунду. Количественные изображения приведены для марганца, меди, железа и цинка. Распределение углерода использовалось в качестве внутреннего стандарта.
Железо в наибольшем количестве обнаруживалось в среднем мозге и зубчатой извилине. Цинк был наиболее выражен в областях коры. Информацию, полученную с этих изображений, затем можно использовать для отслеживания экспрессии и функциональности металлсвязывающих белков. После освоения метода правильно организованный эксперимент, рассчитанный на несколько дней, можно подготовить в течение одного часа.
При выполнении данной процедуры важно синхронизировать линии абляции и файлы данных с ICPMS. После завершения этой процедуры можно применить дополнительные методы, такие как гистологическое окрашивание соседних срезов, чтобы получить дополнительную информацию, например, о колокализации металлов со специфическими белками. Идея этого метода впервые возникла у нас, когда мы хотели изучить, как меняется уровень металлов в лабораторных моделях болезни Паркинсона.
Хотя данный метод может быть использован для изучения нейродегенерации, он также применим для различных типов тканей и патологических состояний, включая ткани человека, а также для ряда биологических матриц. После разработки эта техника позволила исследователям в области нейробиологии изучать изменения уровней металлов как в образцах тканей человека, так и в животных моделях заболеваний. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как организовать эксперимент по лазерной абляции с использованием ICPMS.
Не забывайте, что работа с биологическим материалом может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты.
Обзор
В данной статье представлен протокол количественного картирования металлов в нервной ткани мыши с помощью масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и лазерной абляцией (LA-ICP-MS). Этот высокочувствительный метод позволяет получить данные о распределении металлов, связанных с нормальным функционированием и патологическими процессами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Аналитическая химия
- Металломика
Введение
- LA-ICP-MS сохраняет пространственную информацию о металлах, в отличие от традиционных методов.
- Понимание биохимии металлов имеет решающее значение для исследования заболеваний.
- Данный метод может помочь в мониторинге нейродегенеративных заболеваний.
- Визуальные демонстрации необходимы для эффективного выполнения протокола.
Цель исследования
- Для количественного определения пространственного распределения металлов в срезах тканей.
- Для решения ключевых биологических вопросов, связанных с ролью металлов в развитии заболеваний.
- Для более глубокого понимания механизмов работы металлсвязывающих белков в головном мозге.
Используемые методы
- Подготовка образцов тканей мозга и стандартов в камере лазерной абляции.
- Настройка программного обеспечения ICPMS для сбора данных.
- Проведение лазерной абляции и извлечение данных из CSV-файлов.
- Использование программного обеспечения для количественного построения изображений при анализе данных.
Основные результаты
- Распределение таких металлов, как железо и цинк, было картировано в областях мозга мыши.
- Железо в наибольшем количестве обнаруживалось в среднем мозге и зубчатой извилине.
- Концентрация цинка была максимальной в областях коры.
- Количественные изображения позволили получить представление о функциональности металл-связывающих белков.
Выводы
- LA-ICP-MS является ценным инструментом для изучения распределения металлов в неврологических тканях.
- При наличии опыта экспериментальная установка может быть собрана эффективно.
- Данный метод имеет важное значение для понимания нейродегенеративных заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метод LA-ICP-MS позволяет проводить пространственно-разрешенное количественное определение металлов в тканях головного мозга, восполняя критический пробел в исследованиях нейродегенеративных заболеваний, при которых нарушение гомеостаза металлов происходит в анатомически точно определенных областях. Эта возможность способствует валидации мишеней путем установления связи между распределением металлов и путями, значимыми для заболевания, а также экспрессией белков, что повышает прогностическую достоверность в доклинических моделях. Данный метод предоставляет количественные данные высокого разрешения, которые служат основой для снижения механистических рисков и приоритизации портфеля терапевтических средств, модулирующих обмен металлов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы путем сопоставления распределения металлов с нейроанатомическими областями, связанными с патологией заболевания.
- Практическая ценность: Обеспечивает валидацию функциональных мишеней путем корреляции уровней металлов с экспрессией и активностью металлсвязывающих белков.
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет идентификации региональной дисрегуляции металлов в качестве биомаркера ранних стадий заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем установления базового распределения металлов в тканях дикого типа.
- Практическая ценность: Получение стандартизированных, воспроизводимых количественных данных (PPM), необходимых для нормализации анализа и подготовки к скринингу соединений.
- Научная ценность: Обеспечение надежной оценки соединений путем обнаружения сдвигов в гомеостазе металлов, указывающих на взаимодействие с целевым механизмом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует соответствие системы актуальным аспектам заболевания путем отслеживания изменений содержания металлов в моделях нейродегенерации, таких как болезнь Паркинсона.
- Практическая ценность: обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет последовательного количественного определения металлов в срезах тканей.
- Научная ценность: поддерживает принятие обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении исследования путем выявления патофизиологических признаков, связанных с металлами, до проведения исследований эффективности in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в цикл разработки лекарственных средств — от проверки гипотез о мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинической валидации, предоставляя пространственно-разрешенные данные о металлах, которые позволяют определить биологический механизм и действие соединения.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению метаболических путей, выявляя обогащение металлами в определенных областях, таких как средний мозг и зубчатая извилина для железа, а также области коры для цинка.
- Скрининг: обеспечивает количественные результаты, готовые к анализу, с разрешением в несколько микрометров, что позволяет проводить воспроизводимое картирование металлов в наборах образцов.
- Аналитика: генерирует данные CPS с временным разрешением, преобразованные в PPM с помощью стандартов, обеспечивая статистические показатели для межгруппового сравнения и определения величины эффекта.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя осуществлять лонгитюдное отслеживание изменений содержания металлов в моделях заболеваний, что способствует согласованию биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальная платформа для визуализации металлов в различных типах тканей и при разных патологических состояниях, сокращая необходимость в повторной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет снижения механистической неоднозначности в металлозависимых путях посредством прямой пространственной корреляции.
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет использования матрично-согласованных стандартов и постоянных параметров лазерной абляции.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении исследований, позволяя на ранних этапах выявлять нарушения металлического гомеостаза, что снижает биологические риски на поздних стадиях программ по изучению ЦНС.
- Влияние на портфель: Обосновывает приоритетность с учетом рисков, количественно оценивая взаимодействие с мишенью в стратегиях модуляции металлов в релевантных для заболевания областях мозга.
Особенности внедрения
- Требуются экспертные знания в области параметров лазерной абляции, оптимизации ICP-MS и интерпретации данных металломики.
- Зависит от инструментального оснащения LA-ICP-MS, контроля газа-носителя и программного обеспечения для построения количественных изображений с целью преобразования CPS в PPM.
- Необходима межкомандная стандартизация подготовки образцов, паттернов абляции и протоколов коррекции фона.
- Требуется учет адаптационных факторов, таких как различная толщина тканей, элементный состав и матричные эффекты в зависимости от вида или патологического состояния.
- Включает практические ограничения, такие как маскировка падения сигнала из-за гетерогенности тканей и необходимость последовательных циклов абляции «стандарт-образец-стандарт» для поддержания точности количественного анализа.
