Модель для периневральная инвазия в области головы и шеи карцинома роговых клеток

Общая цель этого экспериментального протокола заключается в быстрой оценке множественных условий лечения, влияющих на периневральную инвазию при плоскоклеточном раке головы и шеи с очень высокими показателями успеха и воспроизводимостью анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии головы и шеи, например, какие факторы влияют на периневральную инвазию клеток рака головы и шеи. Основное преимущество этой методики заключается в том, что большое количество анализов может быть быстро и воспроизводимо выполнено на одной мыши за относительно короткий промежуток времени.

Перед началом процедуры вскрытия ганглия дорсального корешка или DRG добавьте свежую среду комнатной температуры по крайней мере в 40 лунок 96-луночного планшета с V-образным дном. Затем с помощью тонких ножниц сделайте продольный разрез вдоль позвоночного столба от корня хвоста до головы мыши. И поперечно разделить ткани ниже крестцового отдела позвоночника, рассекая обе стороны позвоночника, вплоть до основания черепа.

Перенесите образец под микроскоп и наблюдайте за шейным концом позвоночного столба при низкой мощности. Белый спинной мозг виден в середине костного кольца, которое окружено различным количеством периспинальных мышц и мягких тканей. С помощью микроскопических пружинных ножниц разделите тыльную, или верхнюю, часть первых двух-трех тел позвонков.

Затем используйте пружинное действие ножниц, чтобы открыть этот первоначальный костный разрез, чтобы убедиться, что рассечение тела позвонка происходит по средней линии. Продолжайте небольшими шагами по направлению к крестцовому отделу позвоночника, деля позвоночник пополам с идентичными разрезами на вентральной или нижней стороне тел позвонков. Отложив в сторону одно полушарие позвоночника, другую половину позвоночника перенесите на стерильную пластину с зафиксированным спинным мозгом.

И с помощью двух игл 18-го калибра закрепите оба конца полушария на платформе для препарирования полистирола. Затем, начиная с более узкого, шейного конца, аккуратно отшлифуйте спинной мозг примерно с четырех уровней позвонков. В области, где сенсорные нервы вставляются в DRG, аккуратно захватите окружающую фасцию микроскопическими щипцами и с помощью микроскопических пружинных ножниц обрезайте эту фасцию и другую нервную ткань, чтобы освободить DRG.

При увеличенном увеличении используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать периферический нерв как можно ближе к DRG, чтобы освободить ткань, и обрежьте проксимальные ветви. Затем обрежьте DRG от любых блуждающих нервных волокон или фасциальных прикреплений и поместите изолированную ткань в одну лунку 96-луночной V-образной нижней пластины. Чтобы получить капли полутвердой матрицы, перенесите одну стеклянную пластину со дна льда на ледяную глыбу под операционным микроскопом.

Поместите наконечник пипетки объемом не более 10 микролитров непосредственно на стекло под углом 45 градусов и осторожно нанесите каплю матрицы объемом 1,5 микролитра на стекло. Медленно отодвиньте наконечник пипетки от стекла по мере того, как матрица войдет в зацепление с пластиной. Нанесите по одной капельке матрицы на каждый из четырех углов пластины и перенесите пластину на поверхность с комнатной температурой примерно на одну минуту.

Когда матрица немного напряглась, верните пластину в ледяную глыбу и с помощью закрытых микроскопических щипцов аккуратно зачерпните DRG левой рукой. Правой рукой осторожно перенесите нервную ткань на кончик иглы 21 калибра и с помощью иглы аккуратно введите DRG в середину капли матрицы. DRG должна легко вдаваться в матрицу для центрального позиционирования с помощью иглы.

Вставив кусочек DRG в каждую из четырех капель, поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на три минуты. Когда все DRG будут встроены, держите пластины по одной, под небольшим углом и медленно добавляйте четыре миллилитра DMEM, дополненных 10% FBS, к пластинам, таким образом, чтобы среда только постепенно соприкасалась с матричными блоками DRG. Верните тарелки в инкубатор еще на 48 – 72 часа.

Когда невриты достигнут не менее 75% пути к краю матрицы, отсасывайте среду из скважин, не удаляя матричные блоки DRG. Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров, с плавным триггером, поместите две капли трижды по 10 до пятой клетки на миллилитр среды над каждой матрицей DRG анализа. И вернуть тарелки в инкубатор.

Через час аккуратно добавьте четыре миллилитра DMEM с 10% FBS вдоль боковой стенки стеклянной нижней пластины и верните пластины в инкубатор до их следующей микроскопической оценки. После их рассечения и размещения в каплях матрицы внешний вид анализа должен напоминать показанную здесь DRG, встроенную в матрицу. Обратите внимание, что DRG не имеет идеально круглой формы, а центрирован внутри матричной капли, что позволяет разрастаться нейритам на 360 градусов.

Сразу после нанесения покрытия плоскоклеточные раковые клетки головы и шеи образуют кольцевое кольцо вокруг матрицы, расширяющееся вдоль нейритов в течение следующих двух-трех дней. Ячейки, нанесенные на пустые контрольные капли, содержащие только матрицу, активно делятся вокруг матриц, но не входят и не выходят за их пределы. Для количественной оценки периневральной инвазии раковых клеток изображения анализов разделены на четыре квадранта с помощью одной вертикальной и одной горизонтальной линий.

Затем начисляется ряд баллов за каждое расширение периневральной инвазии, наблюдаемое в каждом квадранте, что позволяет сравнивать врастания раковых клеток вдоль нейритов между различными линиями раковых клеток. После освоения техника выделения ганглиев дорсальных корешков может быть завершена менее чем за два часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно свести к минимуму чрезмерную обработку ганглиев дорсального корешка, поскольку травма от раздавливания является наиболее распространенной причиной неудачного анализа.

После этой процедуры могут быть изучены механизмы периневральной инвазии, что потенциально может привести к разработке таргетной терапии против этого типа инвазии мягких тканей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как рассечь ганглии заднего корешка у мыши и настроить анализ для исследования периневральной инвазии.