Свет лист флуоресцентной микроскопией корней растений, растущих на поверхности геля

Общая цель этой процедуры заключается в получении долгосрочных наблюдений за корневой системой растения с помощью световой листовой микроскопии. Для этого важно иметь щадящий метод подготовки образцов, контролируемые условия выращивания и метод визуализации, который не изменяет развитие растений, такой как световая листовая микроскопия. Для начала растения выращивают на поверхности двухмиллиметрового тонкого слоя геля.

Затем гель с проростком арибидопсиса вырезают, зачерпывают и переносят на держатель для образцов микроскопа. Внутри микроскопа растение растет в естественном вертикальном положении. Корни растут в жидкой среде, в то время как листья остаются в воздухе.

Система освещения освещает только листья. Поверхность воды накрывают для того, чтобы корни оставались в темноте. Одним из основных преимуществ этого метода перед существующими методами, такими как встраивание корня внутрь геля, является то, что мы привыкли выращивать растения на поверхности геля.

Таким образом, мы можем придерживаться того же протокола выращивания, что и раньше. А во-вторых, корень находится в непосредственном контакте с жидкой средой, которую можно обменять, например, на медикаментозное лечение. Налейте 30 миллилитров свежеавтоклавной полуконцентрированной среды МС, содержащей 1,5 процента фитогеля, в квадратную чашку Петри, чтобы получился слой около 2 миллиметров.

Сейте стерильные семена рядом друг с другом с расстоянием не менее одного сантиметра между ними. Затем оберните пластину лентой с микропорами. Выращивайте пластину в инкубаторе роста вертикально в течение 10 дней.

В этом эксперименте мы используем шестидневные растения, чтобы наблюдать за развитием боковых корней. Мы предоставляем модель для 3D-печати держателя образца. Мы протестировали разные материалы.

Прозрачные смолы оказались наиболее подходящими с точки зрения жесткости и водостойкости. Подробное описание размеров для обработки образца держателя из твердого материала описаны в рукописи. Разрежьте гель вокруг растения с помощью скальпеля.

Затем зачерпните блок геля, на котором растет растение, и осторожно переместите его в держатель для образцов. Расплавьте 1 процент агрессивной температуры при 80 градусах Цельсия и охладите до 33 градусов Цельсия. Приклейте блок геля на держатель образца и осторожно приклейте растение на гель.

Используйте стереомикроскоп, чтобы проверить положение растения и убедиться, что интересующая область не покрыта каким-либо гелем. Чтобы предотвратить высыхание растения, по возможности наденьте держатель образца на наконечник для пипетки объемом 1 000 микролитров. Установите держатель на коробку для дозатора и при необходимости подготовьте дополнительные образцы.

Наш микроскоп представляет собой классический микроскоп с открытым спином без каких-либо существенных модификаций. Мы реализовали систему освещения для культивирования растений внутри микроскопа. Красный и синий светодиоды расположены в виде кольца.

Пары светодиодов можно включать и выключать по отдельности для направленного освещения. Спектр освещения системы соответствует спектру в наших камерах выращивания. Почти весь свет, исходящий от светодиодов, блокируется фильтром излучения для GFP.

Мы не смогли обнаружить ни одного постороннего света, достигающего камеры. Таким образом, свет может оставаться включенным во время визуализации. Интенсивность света можно регулировать в диапазоне от 30 до 250 микромолей на квадратный метр в секунду.

Прикрутите или приклейте светодиодное кольцо на нижней стороне открытого рычага спин-сцены. Установите его обратно в микроскоп и подсоедините провода. Соберите систему изобилия.

Подсоедините пробирки к камере для образцов в одностороннем порядке. Отрегулируйте скорость до одного миллилитра в минуту. Добавьте три миллиметровых квадрата стерильной черной пластиковой фольги и распределите их по поверхности воды.

Вставьте образец в микроскоп. Убедитесь, что пластиковые листы не прилипают к держателю для образцов. Закройте камеру двумя крышками из черной алюминиевой фольги.

Включите свет и отрегулируйте интенсивность света. Выключите свет в комнате и начните запись. Этот метод позволяет регистрировать рост корней в течение нескольких часов до нескольких дней, представленный здесь ростом бокового корня.

Изображения z-стека одной временной точки демонстрируют хорошие оптические секционные свойства. Мы запечатлели весь процесс формирования бокового корня в 3D, что позволяет изучать динамику этого процесса. Взгляд на один кусочек этой записи показывает хорошее разрешение, даже глубоко внутри корня.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о методе подготовки образцов растений к световой листовой микроскопии. Следуя этому протоколу, мы теперь можем рассматривать внутриклеточную локализацию белков или паттерны экспрессии генов во время органогенеза, тропизма растений или адаптации растений. Это поможет нам понять пространственно-временную регуляцию развития растений.