Выращивание Caenorhabditis Элеганс В трех измерениях в лаборатории

Общая цель этой процедуры заключается в создании трехмерной системы культивирования нематод, которая может лучше имитировать природные условия. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области развития, физиологии и поведения C. elegans. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы изучали естественное поведение нематод в гниющих фруктах, которые являются трехмерной средой.

Этот метод имеет преимущество по сравнению со стандартными методами двумерного выращивания, потому что нематоды обитают в 3D-средах обитания в природе. Хотя этот метод был разработан для культивирования C. elegans, он также может быть применен к другим нематодам. Демонстрировать эту процедуру будет Тонг Янг Ли, аспирант моей лаборатории.

Чтобы начать эту процедуру, Отто Клаве готовит растворы при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Далее приготовьте 50 миллилитров стерильного раствора холестерина из расчета 5 миллиграмм на миллилитр. В коническую трубку объемом 50 миллилитров добавьте 0,25 грамма холестерина и 50 миллилитров 99,99% этанола и хорошо перемешайте.

Затем простерилизуйте раствор холестерина с помощью шприца объемом 50 миллилитров с вентилируемым шприцевым фильтром 0,45 и удалите весь неразвитый холестерин. Затем привите бактерии в 10 миллилитров отвара лизогении. Культивируйте бактериальный инокуляционный препарат при температуре 37 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе на ночь.

При подготовке к серийному разведению распределите девять миллилитров раствора хлорида натрия в семь стерильных 15-миллилитровых конических пробирок. Сделать палатку из семикратного разведения Opi 50 штамма Е Коли. После этого вытащите один миллилитр бактериальной культуры или разбавленной бактериальной культуры в новую пробирку с девятью миллилитрами раствора хлорида натрия.

И хорошо завихрить смесь. После приготовления бактериальной культуры добавьте 0,6 грамма хлорида натрия, один грамм гранулированного шнека и 0,5 грамма пептона в колбу объемом 500 миллилитров. Поместите в колбу магнитную мешалку.

Затем добавьте 195 миллилитров дистиллированной воды и накройте колбу алюминиевой фольгой. Далее Отто Клаве помещает образец при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. Впоследствии поместите горячую колбу Otto Claved в тарелку для перемешивания, помешивайте с умеренной скоростью не менее двух часов, пока она не достигнет 40 градусов Цельсия.

В качестве альтернативы колбу можно охладить до 40 градусов Цельсия, поместив ее на водяную баню при температуре 40 градусов Цельсия на 15 минут, прежде чем переложить на тарелку для перемешивания. Убедитесь, что достаточно остыло, так как продолжайте отсюда. Высокая температура может привести к помутнению готового шнека, но слишком низкая температура может привести к преждевременному закалке шнека.

Когда температура среды шнека достигнет 40 градусов по Цельсию, добавьте хлорид кальция, раствор холестерина, сульфат магния и буфер фосфата калия и продолжайте помешивать раствор. Для анализа срока службы NGT-3D добавьте 80 микролитров 150-миллиметрового FUDR в среду, чтобы получить конечную концентрацию 120 микромоляров. Затем извлеките шесть миллилитров шнековой среды в стерильную коническую трубку и держите ее в тепле в инкубаторе.

Эта среда будет использоваться для верхнего слоя, свободного от бактерий. Далее добавьте шесть миллилитров разведенной бактериальной культуры в колбу прямо на стерилизованном скамейке. Для NGT-3D налейте 6,5 миллилитров среды в восьмилитровые прозрачные пластиковые пробирки, чтобы образовался слой бактериального шнека.

И осторожно распределите 200 микролитров среды, свободной от бактерий, поверх полутвердой 3D-среды, чтобы сверху получился тонкий слой без бактерий. Затем плотно закройте крышку камеры. Для NGB-3D налейте 65 миллилитров среды в 25-сантиметровую квадратную пластиковую бутылку для клеточных культур.

Затем поместите камеру вертикально при комнатной температуре на одну неделю, чтобы позволить колониям бактерий вырасти до значительного размера, по крайней мере, одного миллиметра в диаметре. В этой процедуре выберите четырехступенчатого червя L и перенесите его на планшет NGM, свободный от бактерий. Затем дайте червю свободно перемещаться в течение нескольких минут, чтобы удалить бактерии из его тела.

И повторите процедуру еще два раза. После этого осторожно поместите чистый червяк на поверхность 3D-носителя. Червь должен был фактически войти в шнек, в 3D-матрицу шнека.

Затем плотно закройте крышку и продолжайте инкубировать в течение 96 часов при температуре 20 градусов Цельсия. Через четыре дня плотно закройте крышку и поместите камеру для культуры NGT-3D в водяную баню при температуре 88 градусов Цельсия, чтобы расплавить шнек. С помощью стеклянной пипетки переложите расплавленный материал на девятисантиметровую пластиковую чашку Петри.

После этого с помощью просвечивающего стереомикроскопа подсчитывают количество червей на стадиях L3, L4 и взрослой особи. Как показано на рисунке, конструкция NGT-3D представляет собой простой и понятный протокол, в результате которого пробирка заполнена шнеком с небольшими колониями бактерий, расположенными по всему шнеку. Чтобы подтвердить, могут ли C. elegans уменьшаться и нормально расти в NGT-3D, фертильность и развитие личинок сравнивали в 3D со стандартными 2D планшетами NGM.

В анализе относительного размера выводка взрослые гермафродиты C. elegans в NGT-3D воспроизводились так же хорошо, как и гермафродиты в стандартных 2D планшетах MGM, когда колонии бактерий многочисленны, по крайней мере, 60 колоний. Кроме того, развитие личинок в NGT-3D также протекает нормально, когда имеется большое количество колоний бактерий, причем большинство червей находятся во взрослом состоянии через 96 часов. Однако, если колонии бактерий разрежены в 3D-матрице, это отрицательно влияет как на относительный размер расплода, так и на развитие личинок.

Вот кривая выживаемости диких элеганов типа C в пластинах NGT-3D или NGM. После освоения этой техники ее можно выполнить за три часа, если она выполнена правильно. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как анализ продолжительности жизни и анализ поведения, чтобы ответить на вопросы о старении и поведении в 3D.

После своего развития этот метод может проложить путь исследователям в области генетики к изучению вопросов экологии и эволюции у C. elegans. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выращивать нематод в 3D-лабораторных условиях.