Бесклеточных ДНК Integrity Анализ проб мочи в

Общая цель этого метода заключается в оценке целостности внеклеточной ДНК мочи в определенных последовательностях онкогенов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области урологического рака, такие как ранняя неинвазивная диагностика рака мочевого пузыря и предстательной железы. Главное преимущество этой методики в том, что ее легко делать и анализировать.

Применение этого метода распространяется на диагностику урологических злокачественных новообразований, поскольку они обычно выделяют клетки и свободные нуклеиновые кислоты с мочой. Хотя этот метод может дать представление о образцах мочи, он также может быть применен к другим системам, таким как сыворотка или плазма. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что концентрация внеклеточной ДНК в моче часто низкая.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы попытались найти простой метод неинвазивного раннего выявления рака мочевого пузыря. Чтобы начать процедуру, возьмите 50 миллилитров чистого улова первого утреннего образца мочи, который хранился при температуре четыре градуса Цельсия не более трех часов. Дважды переверните образец, а затем разделите образец на две 50-миллилитровые конические центрифужные пробирки.

Центрифугируйте образец при 850 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем для каждой трубки переложите по 10 миллилитров верхней части надосадочной жидкости в две пятимиллилитровые трубки, оставив над гранулой не менее двух миллилитров надосадочной жидкости. Выбросьте гранулы и храните надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов Цельсия.

При необходимости повторите этот процесс для получения дополнительных образцов мочи. Чтобы начать очистку ДНК, для каждого образца размораживают аликвоту надосадочной жидкости мочи. Сделайте вихревой поток размороженного образца и дважды переверните пробирку.

Поместите один миллилитр образца в пятимиллилитровую пробирку, а оставшуюся часть храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Подготовьте набор для очистки ДНК, подходящий для образцов мочи в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте в образец 100 микролитров протеиназы К и один миллилитр буфера для лизиса и хорошо перемешайте пипеткой.

Инкубируйте образец при температуре 56 градусов Цельсия в течение 15 минут. Во время инкубации подготовьте промывочные буферы в отжимной колонне. После инкубации дайте образцу остыть до комнатной температуры, а затем добавьте один миллилитр абсолютного этанола и хорошо перемешайте с помощью пипетирования.

Перенесите 650 микролитров образца в колонку. Центрифугируйте при 6000 умноженных на G в течение одной минуты. Установите на место пробирку для сбора и повторяйте этот процесс до тех пор, пока весь образец не будет загружен в колонку.

Затем добавьте 500 микролитров первого промывочного буфера и центрифугируйте колонку при 6000 умноженных на G в течение одной минуты. Установите на место сборную трубку, добавьте 500 микролитров второго промывочного буфера и центрифугируйте колонку на максимальной скорости в течение трех минут. Поместите колонку в чистую сборную трубку и центрифугируйте на максимальной скорости еще три минуты, чтобы удалить остатки промывочного буфера.

Переложите колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Загрузите 50 микролитров элюирующего буфера в колонку и дайте буферу впитаться в колонку в течение семи минут. Затем центрифугируйте колонку при 6000 G в течение одной минуты.

Пипеткой направьте элюат обратно в колонку и центрифугируйте колонку с максимальной скоростью в течение одной минуты, чтобы получить внеклеточную ДНК мочи. Чтобы начать подготовку стандартов, сначала выделите ДНК из соответствующей клеточной линии с помощью набора для очистки. Количественно оцените ДНК из каждого очищенного образца мочи в клеточной линии с помощью спектрофотометра в соответствии с инструкциями производителя набора.

Разбавьте ДНК UCF до одного нанограмма на микролитр и храните разведенные образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к тесту на целостность. Разбавьте ДНК клеточной линии, чтобы получить шесть 100 микролитров стандартов разной концентрации. Хранить нормы при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Чтобы начать тест на целостность ДНК, разморозьте образцы ДНК UCF, стандарты, соответствующие ПЦР-праймеры и зеленую суперсмесь на льду. Затем установите 72-луночную дисковую пластину ротора с полосовыми трубками. Поместите в лунки две, 10 микролитров стандартных аликвот, а затем каждую пробу.

Приготовьте две лунки с 10 микролитрами воды, не содержащей РНКазы, в качестве отрицательного контроля. Для каждой заполненной лунки приготовьте смесь из одного микролитра каждой грунтовки, 12,5 микролитров зеленой суперсмеси и 6,5 микролитров воды, не содержащей РНКазы. Перелейте по 15 микролитров смеси в каждую заполненную лунку, а затем переложите лунки в диск ротора на 72 лунки.

Проведите ПЦР с помощью прибора в реальном времени в соответствии со спецификациями производителя. С помощью программного обеспечения прибора проверьте, имеют ли какие-либо реплики разность пороговых значений цикла в один или более. Отбросьте эти образцы из анализа и оцените средний порог цикличности для оставшихся образцов.

Проведите анализ плавления на каждом образце со средним пороговым значением цикличности 36 или менее, чтобы оценить специфичность продукта ПЦР. Затем используйте стандартную кривую для определения концентрации в нанограммах на микролитр для каждого применения. Была выделена внеклеточная ДНК мочи и оценена целостность ДНК в четырех областях, которые демонстрируют повышенное количество копий ДНК в солидных опухолях.

Контрольная последовательность также была оценена, чтобы убедиться, что количество ДНК в каждом образце было достаточным для проведения теста на целостность. Для каждого гена рассчитывали общую концентрацию свободной ДНК и коэффициенты вариации. Этот метод показывает 73% чувствительности и 84% специфичности для выявления рака мочевого пузыря, но только 58% чувствительности и 44% специфичности для рака предстательной железы.

После освоения этой техники ее можно сделать за один рабочий день, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как цифровая ПЦР или секвенирование нового поколения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как индуктор числа копий интересующих генов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как очень просто выделить свободную ДНК клеток из мочи и как изучать целостность конкретных областей интереса с помощью ПЦР в реальном времени.