Использование GFP-меченый TMEM184A Построить подтверждения гепарин Receptor идентичности

Общая цель использования конструкции, помеченной GFP, состоит в том, чтобы подтвердить идентичность ранее неизвестного белка с помощью GFP в качестве дескриптора. Этот метод может помочь в функциональной идентификации орфанных генов, когда конкретная активность фермента недоступна для подтверждения. Основное преимущество этой методики заключается в том, что GPF-метка позволяет использовать одну и ту же конструкцию для нескольких типов экспериментов.

Как правило, у людей, которые плохо знакомы с этим методом, могут возникнуть проблемы, потому что трансфекция не всегда приводит к экспрессии сильного конструа, и клетки не всегда оживают. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы начали осознавать трудности идентификации белка с помощью только антител, созданных против него. Начните с ресуспендирования интересующих клеток в одном миллилитре буфера для электропорации с солевым раствором HEPES, и немедленно поместите клетки на лед.

Добавьте в клетки достаточный объем плазмы, помеченной GFP-TMEM184A, чтобы достичь конечной концентрации 20 микрограммов на миллилитр ДНК, и перенесите примерно 0,4 миллилитра клеток в предварительно охлажденную электропорационную кювету. Электропорировать клетки. Затем поместите трансфицированные клетки в чашки для культур тканей и поместите чашки в инкубатор для клеточных культур на 24–72 часа.

Этап трансфекции является наиболее важным этапом процедуры, потому что большая часть оставшейся экспериментальной работы не может быть эффективно завершена, если клетки нежизнеспособны и не экспрессируют значительные уровни конструкции, меченной GFP. В подходящий момент времени эксперимента добавьте 100 мкг на миллилитр родамина гепарина в среду для культуры клеток, экспрессирующую GFP-плазмиды, и инкубируйте клетки, защищенные от света, до тех пор, пока не будет достигнут желаемый уровень окрашивания, наблюдаемый с помощью флуоресцентной микроскопии. Далее промывают клетки PBS и несколько секунд мягкого встряхивания, защищенного от света, с последующей фиксацией 4%-ным параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре с легким встряхиванием.

Чтобы оценить колокализацию кодамин-гепарина, меченного GFP, используйте конфокальный микроскоп с соответствующим возбуждением GFP и родамина и уменьшенными лазерами для визуализации не менее 50 клеток из каждого отдельного эксперимента по мечению. Изучите изображения в соответствующей программе анализа изображений, чтобы определить относительное обнаружение и поглощение родамина в каждой клетке, используя инструмент для обведения клеток на каждом флуоресцентном изображении. Используйте инструмент измерения для определения интенсивности в каждом обведенном пространстве, а затем экспортируйте данные об интенсивности флуоресценции в электронную таблицу, чтобы рассчитать площадь, умноженную на интенсивность, вычитая фон для одинаковой площади для каждой ячейки.

Флуоресценция на клетку может быть затем усреднена для всех клеток, чтобы получить статистически значимые данные. Чтобы облегчить передачу энергии флуоресцентного резонанса от GFP TMEM184A к родамин гепарину, сначала насадите фиксированные GFP TMEM184A трансфицированные клетки, меченные родамином гепарином, на предметные стекла микроскопа. Возбуждайте клетки на частоте 405 нанометров для визуализации излучения родамина с последующим возбуждением на 488 нанометров для визуализации излучения GFP.

Затем возбуждайте клетки на частоте 561 нанометр для второй эмиссионной визуализации родамина. Для визуализации поглощения гепарина родамином живыми клетками засейте 100-миллилитровую культуру сливающейся чашки трансфицированных GFP TMEM184A клеток в 635-миллиметровые чашки для визуализации живых клеток, чтобы получить клетки, близкие к слиянию. Через 48 часов замените надосадочную жидкость питательной средой без фенолового красного и перенесите чашку с клетками в конфокальный микроскоп с нагревательным столиком, установленным на 37 градусов Цельсия.

Сфокусируйте микроскоп и добавьте в клетки 100 микрограммов на миллилитр родамина гепарина при осторожном перемешивании. Затем немедленно начните запись изображений в реальном времени. Если в поле зрения не происходит поглощения гепарина, слегка сдвиньте чашку, чтобы идентифицировать клетки с хотя бы одним зеленым пузырьком, содержащим метку родамина.

Для оценки связывания гепарина in vitro промойте одну 96-луночную пластину с черным покрытием из ативана и одну черную 96-луночную пластину без покрытия 200 микролитрами 0,2% CHAPS PBS pro-well в течение трех пятиминутных промываний с встряхиванием. После последней промывки добавьте 100 микролитров 60 пикомолев на лунку биотинилированного анти-GFP в трех экземплярах в покрытую ативаном пластину для каждой группы обнаружения GFP. Далее добавьте буфер только в контрольные лунки и закупорьте все лунки пластинчатой крышкой на двухчасовую инкубацию при комнатной температуре с встряхиванием.

В конце инкубации промойте все лунки три раза в CHAPS PBS, как показано только что, и добавьте 100 микролитров пяти наномолей на лунку GFP TMEM184A или только GFP в соответствующие лунки в пластине, покрытой ативаном. После часовой инкубации при комнатной температуре с встряхиванием промойте все лунки свежим CHAPS PBS и добавьте по 100 микролитров каждой экспериментальной концентрации флуоресцеина-гепарина в соответствующие тестовые лунки в трех экземплярах, в пластину, покрытую ативаном. Добавьте стандарты концентрации как к пластинам с покрытием ативан, так и к пластинам без него, и инкубируйте обе пластины в течение 10 минут при комнатной температуре, встряхивая, в защищенном от света месте.

Теперь с помощью считывателя планшетов можно записать начальное излучение гепарина-флуоресценции в контрольных лунках обоих планшетов и начальное общее излучение флуоресценции из лунок с иммобилизованным TMEM184A GFP или GFP в пластине с покрытием из ативана. Затем переведите несвязанный флуоресцентный гепарин из лунок с иммобилизованным TMEM184A GFP или GFP в соответствующие лунки в черной пластине без покрытия. После немедленного считывания показаний флуоресцентного излучения на черной пластине без покрытия добавьте 100 микролитров свежего CHAPS PBS обратно в лунки, из которых был удален флуоресцеин-гепарин, и считайте флуоресцентное излучение для этих лунок, чтобы получить флуоресцентное излучение от удаленных, несвязанных образцов в пластине без покрытия.

Когда все несвязанные показания будут получены, используйте общие значения эмиссии гепарина, чтобы подтвердить, что правильные уровни гепарина были добавлены в каждую скважину, путем вычитания средних фоновых показаний из значений. Затем создайте график зависимости излучения от общего количества добавленного флуоресцеина-гепарина, чтобы определить масштаб излучения в зависимости от количества гепарина, и построите график скорректированного связанного гепарина в зависимости от добавленного гепарина для трипликатов из TMEM184A скважин GFP и GFP. Продолжительность времени после трансфекции влияет на распределение TMEM184A GFP, которое, по-видимому, накапливается в течение как минимум 72 часов, причем большее количество GFP со временем проявляется в парануклеарной области.

Картина окрашивания GFP в этой репрезентативной культуре сосудистых клеток, по-видимому, наиболее схожа с картиной окрашивания антитела, выращенного против С-концевого пептида, что является логичным результатом, учитывая, что GFP находится на С-конце белка. Использование лиганда флуоресцеин-родамин-гепарин также может быть использовано для оценки колокализации рецептора лиганда в реальном времени с течением времени. Поглощение гепарина увеличивается в GFP TMEM184A конструируют трансфицированные стабильные нокдаун-клетки, в результате чего клетки могут восстанавливать способность интернализировать родамин гепарин на уровне или выше уровня клеток дикого типа.

Используя продемонстрированную плазмидно-кодируемую систему такта GFP, изолированная конструкция GFP антител против GFP TMEM184A демонстрирует специфическое связывание сатрипл-гепарина, в то время как контрольная GFP не связывается с каким-либо гепарином. Простое иммунофлуоресцентное окрашивание антителами снова GFP также может дать информацию о расположении GFP, основанную на доступе антител в непермеабилизированных клетках, обеспечивая предварительные доказательства того, что GFP, экспрессируемый на плазматической мембране, является внеклеточным. После освоения этой техники она может привести к превосходной экспрессии GFP-конструкций после 24-48 часов культивирования.

При попытке использовать протокол визуализации в реальном времени важно помнить, что некоторые клетки могут не демонстрировать ко-локализованное поглощение, поэтому часто необходимо исследовать другие клетки. Анализ связывания с лигандами GFP может быть осложнен димерами или агрегатами белка GFP более высокого порядка, особенно если они находятся в мицеллах детергента. В целом, экспрессия GFP-меченых белков может облегчить проведение широкого спектра экспериментов для подтверждения идентичности ранее неизвестного белка.