Рассечение Слуховые Буллы в постнатальном мышей: Выделение среднего уха Кости и гистологический анализ

Общая цель процедуры вскрытия состоит в том, чтобы изолировать слуховую буллу и капсулу, а затем отдельные слуховые косточки у постнатальных мышей для различных цельных и гистологических анализов. Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов в области биологии ран, таких как механизмы плохого морфогенеза, эндохондрального окостенения или плохого минерального обмена. Этот метод основан на глубоком знании анатомических деталей.

Как правило, индивидуумы, плохо знакомые с мышиной биологической системой, могут испытывать трудности, потому что их знания о среднем ухе человека могут быть неприменимы к мышиному аналогу. Демонстрировать процедуру будет Аяко Сакамото, техник в моей лаборатории. Начните с помещения слуховой буллы и капсулы с окружающей костью черепа в чашку для образцов, содержащую фосфатно-солевой буфер pH 7,4 при комнатной температуре.

Под бинокулярным препарирующим микроскопом определите кости черепа, окружающие слуховую капсулу, как показано на рисунке. Используйте один набор щипцов, чтобы захватить окружающий череп, а второй набор — чтобы оторвать базисфеноид и затылочную кость. Затем с помощью щипцов осторожно оттяните межтеменную и теменную кости от капсулы и удалите после полного ослабления.

Затем оттяните чешуйчатый слой от буллы и капсулы и осторожно отденьте кость и мягкие ткани. Затем возьмитесь за наружное ухо и переверните образец, чтобы открыть медиальную сторону. Далее поверните образец на 180 градусов, возьмитесь за капсулу и оттяните оставшиеся мягкие ткани в сторону.

Теперь виден спинной гребень. Под этим углом хорошо видны лицевой и вестибуло-кохлеарный нервы во внутреннем слуховом проходе, субаркуативная ямка и передний полукружный канал. Когда спинной гребень наклонен к дну чашки для вскрытия, слуховая булла хорошо видна.

Если препарат расположен под небольшим углом, то в пределах буллы виден молоточек. Начните с использования щипцов для перелома наружного слухового прохода, расположенного выше моловидной кости и латерально от барабанной борозды. Создайте вторую фактуру перед первой.

Затем удалите кусочек наружного слухового прохода так, чтобы была видна барабанная перепонка. Затем удалите часть барабанной перепонки и барабанной кости возле лодочного отростка как на вентральной, так и на задней стенках. Теперь должны быть обнажены молотенки, инкус, стремечко и напряженная тимпанная мышца.

Поднимите молоточек и разрежьте тензорную тимпанную мышцу скошенным краем иглы 27 калибра. Обратите внимание, что малая мышца прочно прикрепляется к барабанной перепонке, как это видно у других млекопитающих. Вывихните лодочь от накала в области слухового сустава путем разлома переднего отростка лодыжки в области гониале.

Изолируйте молочек от слуховой буллы с помощью щипцов. Удалите большую часть слуховой буллы, чтобы обнажить инкусы и стремечко. Затем с помощью скошенного края иглы 27 калибра отрежьте заднюю связку инкуса на коротком гребне.

Изолируйте накус с помощью щипцов. Отрежьте стапедиальную артерию возле стремени скошенным краем иглы 27 калибра. Поверните образец так, чтобы круглое окошко располагалось внизу.

Затем вставьте швейную иглу в обтураторное отверстие стремени и поднимите стремечко вверх. После удаления стремени овальный оконный проем должен быть хорошо виден. С помощью иглы 27 калибра оттолкните стремечко от швейной иглы.

Чтобы начать закладку тканей, сначала с помощью ножниц отрежьте шиловидный отросток на переднем конце буллы. Молонек и спинной гребень видны через разрезанную часть. Погрузите буллу и капсулу в 1-2% параформальдегид в PBS.

Если в булле застрял воздух, удалите его с помощью иглы и шприца. Оставьте буллу и капсулу в фиксаторе при температуре четыре градуса Цельсия на ночь на ротаторе с трубкой. На следующий день быстро вымойте буллу и капсулу в PBS.

Затем сразу же погрузите в жидкость крио-встраиваемый состав при температуре четыре градуса Цельсия. Пузырьки воздуха обычно образуются в крио-встраиваемом компаунде на уровне среднего и наружного уха. Удалите пузырьки воздуха из среднего уха с помощью аспирации иглой.

Используйте ту же технику для пузырьков воздуха в наружном ухе. После того, как все пузырьки воздуха будут удалены, сориентируйте ткань в соответствии с типом полученных срезов. Затем ткань может быть встроена в замороженные блоки перед разрезанием.

На этом изображении показано окрашивание H и E продольного парафинового среза декальцинированного молока, обозначенного буквой M, а также слуховой буллы и капсулы мыши P14. Барабанная перепонка обозначается буквой ТМ. На этом изображении показано мечение кальциевой костью продольного среза замороженного недекальцинированного молока, обозначенного буквой М, и слуховой буллы мыши P21. Сигналы зеленого кальция выявляют образование новой кости в молоне, булле и капсуле.

Как только техника будет освоена, слуховая булла и капсула могут быть изолированы за десять минут, если процедура выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление об анатомических ориентациях слуховых косточек и булл у мыши, о которых было рассказано в основном тексте.