Выделение и характеристика Микровезикулы из периферической крови

Общая цель этого метода заключается в характеристике и изучении популяций микровезикул, полученных из плазматических мембран, в периферической крови. Микровезикулы пациентов с опухолями представляют собой проинвазивные и функциональные анализы. Таким образом, дальнейшая характеристика даст информацию о том, как эти везикулы на самом деле способствуют инвазии и метастазированию.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет относительно быстро провести анализ микровезикул в крови, без необходимости использования сложных или дорогостоящих материалов и оборудования. После того, как вы возьмете одну или две пробирки крови от добровольца в пробирки для сбора крови, содержащие ЭДТА, переверните пробирки несколько раз, чтобы гарантировать эффективную антикоагулянтную терапию крови. В течение получаса после забора крови центрифугируйте образцы и добавьте в пробирки фильтр-клапан, чтобы помочь отделить плазму от оставшейся крови.

Перенесите плазму в 15-миллилитровую пробирку для повторного центрифугирования. Соберите надосадочную жидкость и переложите ее в новую пробирку. При необходимости добавьте PBS.

Центрифугируйте плазму, содержащую надосадочную жидкость, разведенную в PBS, по мере необходимости для сбора микровезикул. Затем сцедите надосадочную жидкость и положите трубки вверх дном на бумажное полотенце на три-пять минут. Когда вся оставшаяся надосадочная жидкость впитается в полотенце, удалите остатки плазмы с края трубок и повторно суспендируйте микропузырьковую гранулу в одном миллилитре PBS.

Переложите раствор в микроцентрифужную пробирку на 1,5 градуса. Затем после центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 50-500 микролитрах PBS, в зависимости от размера гранулы. Затем определяют концентрацию белка в микровезикулах с помощью анализа белка.

Чтобы охарактеризовать микровезикулы с помощью проточной цитометрии, перенесите 15 микролитров PBS, дополненных 1% истощенным везикулами FCS, в пробирку проточной цитометрии, а затем от трех до пяти микрограммов микровезикул, взвешенных в PBS. Инкубируйте образец в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы блокировать любое неспецифическое связывание на поверхности микровезикул. Затем добавьте интересующее флуоресцентно меченое антитело для 20-минутной инкубации при комнатной температуре в темноте.

Далее разведите образец в 250 микролитрах свежего PBS, и загрузите микровезикулы в проточный цитометр. Уменьшите порог проточного цитометра до минимально возможного значения и выполните поиск популяции микровезикул с помощью диаграммы прямого и бокового рассеяния в логоритмической шкале. Затем сделайте затвор вокруг популяции микровезикул и оцените флуоресцентный сигнал в соответствующей гистограмме.

Выход микровезикул из образцов донорской крови может быть оценен с помощью анализа белка Лоури с типичным выходом от 10 до 30 мкг везикулы на миллилитр крови и концентрацией частиц в диапазоне от 1,66 умножить на 10 до 9-го до 2,36 умножить на 10-е, как определено с помощью анализа отслеживания межчастичных соединений. Дальнейшая характеристика микровезикул с помощью просвечивающей электронной микроскопии позволяет выявить популяцию везикул диаметром более 100 нанометров, окруженных липидным бислоем, который не содержит клеточных органелл. Анализ отслеживания наночастиц также подтверждает, что средний размер выделенных микровезикул колеблется от 100 до 600 нанометров со средним значением 201 нанометр.

Окрашивание на типичные микровезикулы и экзосомные маркеры с помощью вестерн-блоттинга показывает, что выделенные кровью микровезикулы обычно положительны на тубулант со слабой экспрессией CD9 и CD81, в то время как экзосомы в целом отрицательны на тубулант и обогащены двумя другими маркерами. Проточная цитометрия выявляет определенную популяцию везикул, полученную от донора, которая может быть скобирована с использованием тех же параметров, что и для выделенных микровезикул супернатанта клеточных культур. Это также явно отличается от фонового сигнала, наблюдаемого для контролируемой PBS, дополненной образцами, на 1% обедненными везикулами, содержащими только FCS.

Окрашивание микровезикул установленными маркерами для различных популяций клеток крови показывает, что процент субпопуляций микровезикул различается среди образцов донорской крови, при этом большинство микровезикул, по-видимому, выделяются тромбоцитами во всех образцах. После освоения выделение микровезикул и их последующая характеристика с помощью проточной цитометрии может быть выполнено примерно через 2-1/2 часа. Характеристика субпопуляций микровезикул поможет идентифицировать сигнатуру опухоли у пациентов по сравнению с контрольной группой.

Это может быть полезно в качестве биомаркера для контрдиагностики и терапии.