Cryosectioning соприкасающихся регионов скелетной мышцы одной мыши для экспрессии генов и гистологических анализов

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить анализ гистологических и молекулярных параметров из смежных участков одной ткани. С помощью этого метода мы можем помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии скелетных мышц и заболеваний. Например, каковы регенеративные эффекты после мышечной травмы и каковы последствия доставки вирусных генов путем внутримышечной инъекции?

Преимущество этого метода заключается в том, что гистологические и молекулярные данные могут быть напрямую соотнесены с одной тканью. Это делает анализ данных более эффективным и лучше использует экспериментальные ткани. За пять минут до завершения вскрытия охладите ванну для криоконсервации.

Когда образцы тканей готовы к внедрению, сначала нанесите смолу для встраивания на нижнюю треть или половину ткани, где мышца встречается с пробкой. Это должно быть сделано аккуратно, чтобы уменьшить помехи смолы на последующих ступенях. Затем сразу же опустите пробку в ванну с 2-метилбутаном, охлажденную до минус 140 градусов по Цельсию.

Включайте до восьми тканевых препаратов в партию. В ванне помешивайте ткани в течение 30 секунд, соскребая дно стакана, чтобы пробки от тканей не замерзли в раствор. Через 30 секунд с помощью металлического инструмента вытяните тканевую пробку из 2-Метилбутана.

Затем быстро снимите поддерживающую крышку. Промокните излишки 2-метилбутана обратно в ванну, а затем опустите тканевую пробку во внешнюю азотную ванну. После того, как все ткани были перенесены в жидкий азот, переместите их в контейнер и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

После подготовки криостата и установки образца ткани используйте грубые и тонкие регуляторы, чтобы продвинуть образец к лезвию так, чтобы он соприкасался с лезвием. На этом этапе сумма толщин сечения обнулена. Далее установите криостат на функцию обрезки с толщиной сечения 30 мкм.

И срезать и отбрасывать срезы до нужной глубины ткани. Чтобы эффективно собирать криоссекции для экстракции РНК, сначала откройте пробирку для сбора и поместите ее рядом с держателем лезвия. Там с помощью предварительно охлажденной чистой щетки возьмите каждую секцию и перенесите ее в трубку.

Объединенные 30-микронные передние отделы большеберцовой кости мыши, взятые с глубины от 400 до 4000 микрон, обычно дают от 25 до 50 миллиграммов мышечной массы. Если вкрапленная смола окружает криосекцию, заблокируйте ручной тормоз и используйте лезвие бритвы, чтобы срезать мелкие кусочки смолы, пока вокруг верхней части мышцы не останется только тонкий слой. Всегда режьте смолу лезвием под углом от мышцы.

Тонкий слой встраиваемой смолы существенно не ухудшает последующую экстракцию РНК. Если присутствует более густая смола, используйте щетки, чтобы оторвать ее от мышцы, прежде чем перемещать криосекцию в пробирку для сбора. В процессе среза, когда желательны гистологические срезы, сбросьте толщину среза до семи микрон с помощью криостатного контроля.

Затем разрежьте и выбросьте от четырех до семи срезов, чтобы получить однородную, ровную поверхность ткани, и обратите внимание на глубину этой ткани. Теперь отрежьте хороший участок и сориентируйте его по поверхности держателя лезвия. С помощью предметного стекла микроскопа комнатной температуры возьмите срез и верните предметное стекло к комнатной температуре.

Соберите все нужные срезы, а затем запишите окончательную глубину ткани. После завершения секционирования быстро запишите вес объединенных криосрезов для выделения РНК. Немедленно верните трубку в криостатную камеру, чтобы поддерживать температуру секций вблизи отрицательных 20 градусов Цельсия.

Начните с быстрого переноса объединенных криосекций в лед и добавления примерно одного миллилитра реагента для экстракции органической РНК на 50 миллиграммов криоссечений. Чем раньше будет нанесен реагент, тем меньше РНК будет деградировать. Затем с помощью одномиллилитрового шприца с иглой 18-го калибра гомогенизируйте криосекции без образования слишком большого количества пузырьков, многократно набирая раствор и выбрасывая его на стенки трубки.

Используйте кончик иглы, чтобы разогнать слипшиеся кусочки. После каждых пяти ударов ненадолго возвращайте образец на лед, чтобы он оставался прохладным. После гомогенизации используйте иглу 22-го калибра, чтобы тщательно растирать образец еще пятью мазками.

Затем верните образец в лед. Повторите этот процесс три или четыре раза, чтобы добиться очень мелкодисперсной однородности тканей. Как только окончательный гомогенат будет изготовлен, дайте ему инкубироваться в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы разрушить молекулярные комплексы.

Далее в вытяжной шкаф добавляют 0,1 миллилитра БКП на миллилитр реагента для выделения РНК. Затем энергично встряхивайте трубку в течение 15 секунд. Не используйте вихрь.

Затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение двух-трех минут. После короткой инкубации образец центрифугирует в течение 15 минут при 12 000 г и четырех градусах Цельсия. Затем тщательно соберите прозрачную верхнюю фазу, содержащую РНК.

Переложите его в чистую пробирку и добавьте равный объем 70% этанола, содержащегося в морской воде. После краткого вортекса дайте ему поинкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре и продолжайте, следуя текстовому протоколу. Препараты РНК скелетных мышц были получены из передней большеберцовой кости мыши.

За три дня до этого в некоторые мышцы вводили 10 микромолярного кардиотоксина, а в другие — физиологический раствор. Чистота и выход РНК из этих образцов были превосходными. Выход РНК был значительно выше в передних мышцах большеберцовой кости после повреждения токсинами.

Целостность тканей и производство РНК могут влиять на это наблюдение. Стойкость качества приготовленной РНК оценивали с помощью одного микролитра РНК, хранившейся при отрицательной температуре 20 градусов Цельсия в течение 18 месяцев. Заметные полосы рибосомальной РНК 18S и 28S все еще заметны в образцах, демонстрирующих высокое качество РНК.

Семимикронные срезы окрашивали для экспрессии тяжелой цепи эмбрионального миозина, видимой красным цветом. Для обнаружения регенерирующих волокон, окрашенных на коллаген шесть, виден зеленым цветом, который очерчивает мышечные волокна и окрашен дапти, в синий цвет, наблюдаются ядра. При недостаточной инъекции токсина травма кажется минимальной.

Успешная инъекция токсина приводит к поражению гораздо большей области целевого мышечного отдела. Степень повреждения может быть использована в качестве критерия включения в анализ РНК. После освоения срезы для извлечения РНК и гистологического предметного стекла могут быть выполнены менее чем за полчаса для одной ткани.

После этой процедуры можно следить за другими гистологическими или иммунофлуоресцентными красителями, чтобы ответить на широкий спектр вопросов. Объединенные криоссекции также могут быть использованы для сбора ДНК или белка.