Использование Soft-агара Техника для скрининга бактериально Производимые ингибирующие

Общая цель этой процедуры заключается в скрининге агентов, продуцируемых одним бактериальным штаммом, которые являются ингибиторными по отношению ко второму бактериальному штамму. Этот метод может помочь ответить на вопросы в ряде микробиологических областей, но особенно полезен в экологии микроорганизмов, в понимании антагонистических бактериальных взаимодействий. Основное преимущество этой методики в том, что она недорогая и проста в исполнении и интерпретации.

Демонстрировать процедуру будет Арета, студентка лаборатории. Чтобы начать эксперимент, введите одну колонию P. syringae в 3 миллилитра бульона King's Medium B, или KB. Инкубируйте культуру в течение ночи. На следующее утро разведите культуру бульона в соотношении от 1 до 100 до 3 миллилитров свежего бульона KB.

Инкубируйте культуру в течение трех-четырех часов с встряхиванием при комнатной температуре. Следите за тем, чтобы в культуре наблюдалось заметное повышение мутности, а затем добавляйте Митомицин С. Далее инкубируйте культуру в течение ночи с встряхиванием при комнатной температуре. На следующий день гранулируйте один-два миллилитра митомицина С индуцированными культурами в настольной микроцентрифуге.

Удалите и простерилизуйте надосадочную жидкость культуры, пропустив надосадочную жидкость через фильтр размером пор 0,22 мкм. Добавьте хлорид натрия до достижения одной молярной концентрации и добавьте полиэтиленгликоль или ПЭГ 8000 до конечной концентрации 10% в стерильный надосадочный жидкость. Многократно переворачивайте образцы, пока хлорид натрия и ПЭГ полностью не растворятся.

Инкубируйте образцы в ледяной бане в течение часа. Далее центрифугируйте образцы. После отжима сцедите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в буфере путем многократного пипетирования.

Удалите остатки ПЭГ двумя последовательными экстракциями с равным объемом хлороформа. Соедините с хлороформом с повторно суспензионной гранулой и перемешайте смесь в течение 15 секунд. Затем центрифугируйте смесь при 20 000 умноженных на G в течение пяти минут.

Перенесите верхнюю водную фазу в свежую микрофуговую пробирку. Повторите эту экстракцию два раза, пока не исчезнет белая граница раздела между водной и органической фазой. Дайте остаточному хлороформу испариться из экстрагированных надосадочных зонтов в вытяжном шкафу.

Инокулируйте одну колонию штамма P. syringae в три миллилитра KB и инкубируйте культуру в течение ночи, встряхивая при комнатной температуре. На следующее утро разведите культуру от 1 до 100 в свежую KB. Инкубируйте культуру в течение трех-четырех часов с встряхиванием при комнатной температуре. Далее готовят стерилизованный водный агар путем автоклавирования суспензии агара в сверхчистой воде.

Перед использованием расплавленный мягкий агар следует держать на водяной бане при температуре 60 градусов Цельсия. С помощью стерильной серологической пипетки переложите три миллилитра мягкого агара в стерильную пробирку для культуры. Верните пробирку с культурой на водяную баню для поддержания ее в расплавленном состоянии.

Перед заливкой накладки дайте расплавленному агару остыть, но не дайте ему застыть. Крайне важно, чтобы агар поддерживался в горячем, полностью расплавленном состоянии перед инокуляцией. В противном случае накладка будет иметь зернистый вид и будет сложнее интерпретировать.

В стерильном колпаке инокулируйте 100 микролитров культуры штамма тестера в мягкий агар и вортекс для смешивания. Поверните культуру вручную в течение 10-15 секунд, затем вылейте ее на дно агаровой пластины. Наклоните пластину во всех направлениях, чтобы мягкий агар равномерно покрывал нижний агар.

Накройте тарелку крышкой и дайте ей застыть от 20 до 30 минут. Будьте осторожны, чтобы не потревожить пластину во время застывания. После застывания нанесите на накладку от двух до пяти микролитров надосадочной жидкости.

Дайте планшетам поинкубироваться в течение ночи при комнатной температуре. Наблюдайте и записывайте результаты на следующее утро. С помощью этого метода два штамма P. syringae ингибируются разными бактериоцинами.

Штамм А чувствителен к высокомолекулярному бактериоцину тайлоцину, но не чувствителен к альтернативному, низкомолекулярному бактериоцину. И наоборот, штамм B нечувствителен к тайлоцину, но чувствителен к низкомолекулярному бактериоцину. Тайлоцин эффективно восстанавливается после осаждения ПЭГ, в то время как бактериоцины с более низкой молекулярной массой этого не делают.

Опосредованное бактериофагами уничтожение отличается от других нерепликативных противомикробных препаратов путем сравнения ряда разведения. В случае опосредованного бактериофагами очищения, разведение надосадочной жидкости растворялось в отдельных бляшках или зонах очищения, в то время как опосредованное бактериоцином очищение не растворялось в таких бляшках. Эта процедура может быть использована в качестве первоначального скрининга для идентификации ингибирующих агентов и может быть объединена с последующими генетическими манипуляциями для идентификации или подтверждения источника этой активности.