Картирование участок связывания аптамер на АТФ Использование Microscale Термофорез

Общая цель этого эксперимента — охарактеризовать взаимодействия малых молекул аптамеров ДНК, включая картирование сайтов связывания, с помощью микромасштабного термофореза. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об основных параметрах связывания молекулярных взаимодействий. Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она не зависит от размера партнера по взаимодействию, что позволяет получать данные контроля качества сложных взаимодействий между аптамерами и малыми молекулами.

Хотя этот метод может дать представление о взаимодействиях малых молекул аптамеров, он также может быть применен к другим молекулярным взаимодействиям, таким как лекарство-мишень или взаимодействие антиген/антитело. Чтобы начать процедуру, приготовьте 100 микромолярный стоковый раствор меченого Cy5 аптамера DNA DH25.42 в дистиллированной воде. Затем разбавьте стоковый раствор аптамера до 200 наномоляров со связующим буфером.

Инкубируйте рабочий раствор аптамера в течение двух минут при температуре 90 градусов Цельсия. Остудите раствор до комнатной температуры на льду. Затем промаркируйте и установите микроцентрифужные пробирки с низкой связываемостью 200 микролитров для 16-ступенчатого серийного разведения испытуемого лиганда.

Пипеткой 20 микролитров 10 миллимолярного стокового раствора лиганда и связывающего буфера в пробирку 1. Пипеткой 10 микролитров связывающего буфера в пробирки со 2 по 16. Затем переложите 10 микролитров запаса лиганда из пробирки 1 в пробирку 2 и хорошо перемешайте пипеткой.

Переложите 10 микролитров разведенной смеси в тюбик 3 и хорошо перемешайте. Продолжайте серийное разведение таким образом, при необходимости корректируя эффекты разбавления буфера, и по окончании выбросьте лишние 10 микролитров из пробирки 16. Добавьте по 10 микролитров рабочего раствора аптамера в каждое разведение и хорошо перемешайте пипеткой.

Инкубируйте образцы в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем втяните каждую смесь в чистый стандартный капилляр, обязательно касаясь капилляра только на концах. Поместите капилляры в держатель лотка в порядке убывания концентрации.

Запустите устройство MST и откройте программное обеспечение для управления прибором. Включите ручную регулировку температуры и установите температуру прибора на 25 градусов Цельсия. Как только инструмент нагреется до нужной температуры, вставьте капиллярный лоток.

Установите светодиодный канал в положение красного для аптамера с маркировкой Cy5. Установите мощность светодиода для получения флуоресцентного сигнала 500 единиц. Затем выполните сканирование капилляров, чтобы получить положение капилляров и проверить качество образца.

Если полученные пики имеют U-образную форму или уплощены, подготовьте новые образцы в закодированных капиллярах, чтобы свести к минимуму эффект прилипания. В программном обеспечении прибора MST введите концентрацию лиганда и тип разведения для первого капилляра. Щелкните и перетащите, чтобы заполнить концентрации и разведения для оставшихся капилляров.

Введите концентрацию аптамера в итоговую смесь. Убедитесь, что метод эксперимента настроен на обнаружение флуоресценции в течение пяти секунд, запись MST в течение 30 секунд, а затем запись флуоресценции в течение пяти секунд после выключения лазера. Установите мощность лазера на 20%Задайте путь к файлу и сохраните файл эксперимента.

Затем начните измерение MST. Таким образом необходимо провести не менее трех измерений. Чтобы начать анализ данных, откройте программное обеспечение для анализа MST и загрузите файл эксперимента.

Выберите MST в качестве типа анализа. Аналитическое программное обеспечение позволяет сравнивать технические повторы, где все измерения были одного и того же набора капилляров. К анализу также могут быть добавлены биологические повторы из другого набора капилляров.

Нажмите кнопку с информацией под первым измерением. Осмотрите трассы MST на наличие неровностей или пиков, указывающих на агрегацию или осадки. Затем осмотрите капиллярное сканирование и наложение формы капилляра на наличие плоских или U-образных пиков, указывающих на эффект прилипания или абсорбции.

Поскольку агрегаты и эффекты поглощения быстро обнаруживаются в MST, этот метод позволяет быстро и быстро оптимизировать техническую установку для обеспечения оптимального качества данных. Проверьте наличие лиганд-зависимых эффектов гашения или усиления флуоресценции при капиллярном сканировании и начальной флуоресценции. Проверьте изменение флуоресценции с течением времени на наличие признаков фотообесцвечивания или улучшения фотографии.

После проверки качества данных переключитесь в режим реакции на дозу. Выберите настройку экспертного анализа в стратегии оценки T Jump MST. Затем выберите модель холма для подгонки кривой, чтобы автоматически рассчитать параметры привязки.

В меню сравнения результатов выберите тип нормализации. Экспортируйте нормализованные данные в виде таблицы или файла PDF. В этой процедуре MST был использован для исследования связывающих взаимодействий одноцепочечного ДНК-аптамера с выбором низкомолекулярных лигандов.

Кривые MST были согласованы с уравнением Хилла и определены полумаксимальные значения эффективной концентрации. В пяти независимых биологических повторных измерениях аптамера с АТФ взаимодействие аптамера АТФ показало отрицательную амплитуду связывания от 6 до 13 единиц и среднее значение EC50 около 52,3 микромоляра. Данные для каждого лиганда нормализовали до доли связанных молекул, а затем сравнили.

Значения EC50 для АДФ, АМФ и SAM по сравнению с АТФ свидетельствуют о том, что количество фосфатных групп оказывает в лучшем случае незначительное влияние на поведение связывания аптамера. Удаление роботизированной группы C2 hydroxal также показало лишь незначительное влияние на аффинность связывания аптамера. Аптамер не связывался при отсутствии группы спаривания или при изменении группы спаривания на гуанин.

Аптамер связывался только с аденином, что еще раз указывает на то, что адениновая группа является основным сайтом связывания для аптамера. После освоения этой техники она может предоставить необходимую информацию об основных параметрах привязки за считанные минуты или часы, если она выполнена правильно.