Капиллярный электрофорез Разделение моноклональных антител изоформ с нейтральным капилляра

В настоящее время метод капиллярного электрофореза является одним из наиболее эффективных и чувствительных способов анализа биомолекул, таких как моноклональные антитела. Однако успешное применение этого метода зависит от знаний и навыков аналитика при выполнении критических этапов подготовки системы и образцов. Данное руководство посвящено тому, как провести успешный анализ; в нем представлены подробные объяснения по приготовлению растворов и образцов, подготовке системы капиллярного электрофореза, настройке параметров прибора, а также интерпретации и обработке данных.

В целом данный протокол может быть использован для развития и совершенствования навыков персонала, занимающегося подготовкой лабораторий аналитической химии. Отвесьте количество HPMC, необходимое для получения конечной концентрации 0,05% в 100 мл. Поскольку HPMC представляет собой базовый эластичный полимер, на первом этапе засыпьте порошок в стеклянный стакан и медленно добавьте 80 мл воды для дезагрегации порошка.

Затем промойте лоток для увлажнения водой, чтобы удалить остатки порошка. Добавьте остальные реагенты в обычном порядке и перемешайте раствор. Доведите значение pH до 4.8 с помощью 50% раствора уксусной кислоты.

Дайте раствору стабилизироваться в течение пяти минут. После этого при необходимости отрегулируйте pH. Добавьте воду до достижения конечного объема 100 мл.

Профильтруйте приготовленный раствор BG через нейтральный мембранный фильтр и перелейте его в стеклянный флакон. Затем надлежащим образом промаркируйте флакон и храните его в холодильнике. Для подготовки образца на первом этапе добавьте 162 µL раствора буфера для микроэлементов в пробирку объемом 1.5 мл.

Затем добавьте 18 µL предварительно подготовленного образца MAP в концентрации 10 mg/mL. На третьем этапе добавьте 20 µL предварительно подготовленного 1% раствора гистамина, чтобы довести конечный объем образца до 200 µL. Следующий шаг — подготовка образца в течение пяти секунд.

Центрифугируйте в течение пяти секунд. Аспирируйте весь объем образца. Перенесите его в микропробирку, направляя дозатор вверх, чтобы избежать образования пузырьков воздуха.

В завершение закройте флакон крышкой и храните его в холодильнике. Выключите прибор для капиллярного электрофореза (CE), нажав выключатель питания. Затем откройте переднюю дверцу.

Поместите новую одноразовую салфетку под интерфейсный блок. Промойте электроды в интерфейсном блоке водой с помощью rửa-бутылки. Дайте воде стечь через отверстия и тщательно просушите интерфейсный блок.

Осторожно удалите излишки воды с электродов с помощью салфетки. Будьте внимательны, чтобы не касаться электродов во время этой процедуры. Извлеките салфетку из системы удержания образца.

Очистите поверхность лотков для образцов новой салфеткой, смоченной водой. Также очистите поверхность лотков для буфера. Сдвиньте лотки для буфера вверх, поднимите систему удержания образцов и очистите их поверхность с помощью салфетки.

Верните лотки с буфером в исходное положение. После этого тщательно очистите интерфейсный блок. Очистите зажимную планку и корпус УФ-лампы.

В конце обязательно протестируйте систему перед использованием. Промойте рычаги открытия водой из промывочной бутыли. Тщательно очистите их поверхность новой неподвижной салфеткой, чтобы удалить пыль и накопившиеся соли.

Наконец, перед установкой обязательно проверьте их работоспособность. Очистите оба конца волоконно-оптического кабеля салфеткой из микрофибры, смоченной водой, и убедитесь в наличии светового сигнала между концами. Извлеките новый нейтральный капилляр из упаковки.

Теперь поднесите один конец защитной трубки капилляра к рабочему столу. Размотайте и выпрямите пластиковую трубку, затем осторожно вытяните из неё капилляр. Прикрепите к рабочему столу лист бумаги с нанесенными на него измерительными метками.

Сопоставьте окно капилляра с нулевой отметкой сантиметровой шкалы следующим образом: после этого закрепите концы капилляра на рабочем столе с помощью клейкой ленты. Отметьте концы капилляра на расстоянии двух миллиметров за пределами измерительных меток. Отрежьте защитный колпачок на конце капилляра, который находится дальше всего от окна.

Погрузите конец капилляра в виалу для КЭ, заполненную водой, чтобы избежать необратимого повреждения внутреннего покрытия капилляра. Извлеките капилляр из виалы и осторожно вставьте этот конец в выходную сторону картриджа. Как только капилляр появится с другой стороны, вытяните его на необходимую длину, пока окно капилляра не окажется по центру окна картриджа, как показано далее.

После этого переверните картридж и вставьте пробку апертуры в окно картриджа, нажав до щелчка. Будьте осторожны, чтобы не повредить окно капилляра во время этой процедуры. Убедитесь, что при воздействии широкого источника света через окно проходит свет.

Введите капилляр в предварительно сформированную трубку охлаждения с предварительно установленной трубкой и уплотнительным кольцом. Протолкните капилляр через трубку до тех пор, пока он не появится с другой стороны. Затем вставьте конец трубки в выходное отверстие картриджа и затяните гайки трубки.

Вставьте входной конец капилляра во входную сторону картриджа. Когда капилляр появится с другой стороны, при необходимости вытяните его. После этого вставьте конец трубки во входную сторону картриджа и затяните гайки трубки.

Отрежьте защитный колпачок на конце капилляра, ближайшем к окну. Установите зажимы-фиксаторы кюветок на концах капилляров, нажав до щелчка, как показано далее. Отрежьте концы капилляров ниже контрольных линий на пластинах для удлинения капилляров.

Обязательно осмотрите концы капилляров с помощью увеличительного стекла. Если концы капилляров не гладкие, отполируйте их с помощью камня Cleven. Установите уплотнительное кольцо апертуры в синее отверстие апертуры.

Аккуратно вставьте его с помощью инструмента для установки уплотнительного кольца. Наконец, поместите в корпус картриджа флаконы для капиллярного электрофореза (CE), заполненные водой, немедленно установите картридж в корпус так, чтобы концы капилляров находились во флаконах, и храните в охлажденном состоянии. Отрегулируйте объем дозатора.

Добавьте соответствующий объем воды в отверстия для ввода буфера в лотке по координатам A1, B1 и F6, а также в отверстия для вывода буфера по координатам A1, B1, C1, E6 и F6. Добавьте 0,1 н. раствор HCl в отверстия для ввода буфера по координатам C1 и E6. Добавьте BGE в отверстия для ввода буфера по координатам D1 и E6, а также в отверстие для вывода буфера по координате D1. В завершение закройте крышками все кюветы CE в лотках ввода и вывода буфера. В ходе процедуры избегайте попадания жидкости на крышки кювет, чтобы предотвратить утечку углерода. Откройте переднюю дверцу прибора CE.

Сначала установите УФ-детектор и закрепите его, повернув винт по часовой стрелке. Поднимите внутреннюю дверцу и установите рычаги открывания, нажав на них до фиксации в интерфейсном блоке. Вставьте оптоволоконный кабель в зажим и поверните его по часовой стрелке.

Подсоедините другой конец к детектору. Осторожно обращайтесь с оптоволоконным кабелем, так как изгиб может привести к его разлому. Поместите кювету с образцом в систему удержания образцов и зафиксируйте ее на месте.

Следуя той же процедуре, установите лотки с буфером в систему удержания образцов. Поднимите зажимную планку и поместите капиллярный картридж в интерфейсный блок. Нажмите на зажимную планку с обоих концов и затяните ручки, поворачивая их по часовой стрелке.

Закройте внутреннюю дверцу, а затем переднюю дверцу. В завершение включите прибор для капиллярного электрофореза (CE), нажав кнопку питания. Создайте метод кондиционирования прибора.

Настройте параметры в разделе начальных условий, включая напряжение, картридж, температуру хранения образцов и настройки триггера. Выберите 2014 в качестве длины волны регистрации. Определите действия, которые должен выполнить прибор, настроив параметры в ячейках временного программирования.

Укажите конкретные параметры для каждого этапа промывки, ввода пробы и разделения. Выполните эту процедуру для создания методов кондиционирования, анализа и завершения работы прибора. Следующим шагом является создание новой последовательности.

Запрограммируйте капилляр для кондиционирования, используя метод кондиционирования. Если капилляр используется впервые, установите четыре повторения. В противном случае установите два повторения.

Затем запрограммируйте образцы для анализа, используя метод запуска. В завершение запрограммируйте капилляр для хранения, используя метод выключения. Анализ методом капиллярного электрофореза занимает не более 30 минут.

Первый результат соответствует внутреннему стандарту гистамина, который служит мерой адекватности работы системы. Далее следуют отчетливые основные, нейтральные и кислые изоформы оцениваемого моноклонального антитела. Все разделение проводится при постоянном токе около 30 µA.

После проведения эксперимента экспортируйте необработанные данные из программного обеспечения Grab и импортируйте их в программное обеспечение Empower для обработки. Процентное содержание каждой формы изоэлектрического фокусирования получают путем вертикального интегрирования линий профиля электрофореграммы. Ниже представлено подробное пошаговое руководство по анализу активности моноклональных антител, полученное методом капиллярного электрофореза клеток.

Наряду с несколькими рекомендациями по минимизации возможных проблем, данный протокол обладает преимуществом в виде возможности легкой адаптации для анализа других белков путем внесения незначительных изменений в параметры проводимости и pH.