Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Общая цель этого метода по изготовлению гидрогелей по индивидуальному заказу заключается в изучении клеток и условий культивирования, которые воспроизводят сложность внеклеточного матрикса легких. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области легких, например, как клетки легких взаимодействуют с ЭКМ в здоровых и патологических условиях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что гидрогели для легких ECM можно адаптировать к вашему применению в 2D или 3D культуре.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за сложности методов децеллюляризации, иногда требующих нескольких человек и внимания к деталям для оптимизации количества жизнеспособной ткани. Для этого протокола подготовьте легкое свиньи к децеллюляризации. Подробно о его подготовке можно прочитать в текстовом протоколе.

После того, как легкое будет подготовлено, используйте ручной насос, который канюлируется по размеру легочной артерии. Сначала перфузируйте около одного литра воды в сосудистую сеть, а затем 1,5 литра в трахею. Проделайте это три раза, увеличивая объем перфузированной воды, так как удаляется клеточный мусор.

Далее перфузируйте ткань с помощью Triton X-100, также с помощью ручного насоса. Затем погрузите ткань в ванну с раствором Triton X-100 при температуре четыре градуса Цельсия на 24 часа. Через 24 часа трижды промыть сосудистую сеть и трахею дистиллированной водой.

После полосканий с помощью ручного насоса профузируйте ткань дезоксихолатом. А затем погрузите ткани в дезоксихолат на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день трижды промойте ткань дистиллированной водой, как и раньше.

После полосканий с помощью ручного насоса процедите салфетку с отфильтрованным хлоридом натрия. Затем погрузите ткань в отфильтрованный хлорид натрия на час при температуре четыре градуса Цельсия. После ванны трижды пронзите сосудистую сеть и трахею дистиллированной водой для полоскания.

После полоскания перфузируйте ткань раствором ДНКазы, а затем погрузите ее в раствор ДНКазы на один час при температуре четыре градуса Цельсия. Через час пять раз перфузируйте сосудистую сеть и трахею, используя PBS, а не воду. Теперь, используя только непрозрачную белую ткань, рассеките все канальцы диаметром два миллиметра или больше.

В основном они обнаруживаются вокруг ворот и медиальных отделов легких. Оставьте нетронутыми дыхательные зоны, которые в основном находятся на периферии. После удаления канальцев рассеките ткань на участки размером в один дюйм или меньше.

Ориентация этих блоков не важна. После дренирования тканевых блоков переложите их в коническую трубку объемом 50 миллилитров и заморозьте при температуре 80 градусов Цельсия. Несколько блоков могут быть отведены для гистологии, чтобы подтвердить удаление клеток и остатков.

Чтобы превратить легочную ткань в децеллюляризованный порошок, замените крышку на пробирке из замороженной ткани фильтровальной бумагой и закрепите ее эластичной лентой. Затем лиофилизируйте ткань до тех пор, пока вся лишняя жидкость не исчезнет, используя сублимационную сушилку в соответствии с инструкциями производителя. Затем храните ткань при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока ее можно будет измельчить.

Чтобы подготовить мельницу, сначала загрузите ее жидким азотом, оставив место для мельничной трубы. Далее из мельничной трубы снимите магнитный брусок мельницы и накройте дно трубки салфеткой. Затем установите на место стержень мельницы и неплотно набейте больше ткани, чтобы заполнить трубу.

Затем закройте трубу мельницы, поместите ее в морозильную камеру/мельницу и заполните мельницу жидким азотом до максимальной производительности. Теперь запустите мельницу примерно на пять минут со скоростью соударения около 600 в минуту. Затем храните децеллюляризованный порошок при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока он не понадобится.

Чтобы сделать предварительно гелевый материал, добавьте в коническую трубку децеллюляризованный тканевый порошок и пепсин. Затем добавьте в пробирку 0,01 молярной соляной кислоты, для конечной концентрации 1% порошка децеллюляризированной ткани, и 0,01% пепсина. Держите этот раствор при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 48 часов для переваривания тканей.

Через 48 часов положите раствор на лед на пять минут. Теперь отрегулируйте pH раствора до 7,4 с помощью холодного 0,1 молярного гидроксида натрия, а затем доведите концентрацию PBS в растворе до 1X, добавив 10X PBS. У нас есть некоторый опыт изменения времени и pH предварительного геля.

Существует некоторая гибкость в диапазоне, который можно использовать, но свойства могут резко измениться, если процедура будет изменена незначительными способами. Раствор не считается предварительно гелевым и может быть использован для нанесения покрытия на необработанные пластины с образованием гидрогелей для формирования клеток, для формирования гидрогелей для формирования клеток, или он может быть дополнительно модифицирован перед формированием гидрогелей для повышения жесткости гидрогелей. Для культивирования клеток на двумерном микропористом гелевом покрытии добавляют 20 мкл предварительного раствора в лунки 96-луночного необработанного тканевого культивального планшета.

Затем поставьте тарелку в холодильник на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы белки впитались на тарелку. На следующий день отсадите прегелевый раствор и промойте лунки PBS. Затем добавьте по 3 200 ячеек в каждую лунку и долейте объем среды в каждой лунке до 100 микролитров.

Затем планшеты можно инкубировать. Для трехмерной клеточной культуры с клетками внутри микропористого геля ресуспендируйте интересующие клетки в дозе один миллион на миллилитр в растворе предварительного геля. Затем быстро дозируйте 16 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, чтобы сформировать 3D-культуру клеток толщиной около 500 микрон.

Гель образуется через 30 минут после инкубации при 37 градусах Цельсия. После того, как гели сформируются, добавьте в лунки среды до 100 микролитровых отметок. Для трехмерной клеточной культуры с клетками поверх микропористого геля добавьте 100 микролитров предварительного раствора в лунки необработанного 96-луночного планшета.

Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут для гелеобразования. Как только гели сформируются, добавьте 3 200 клеток в 100 микролитровых средах поверх гидрогелей и приступайте к инкубации пластины. Гидрогели получали из нормальных легких свиней, крыс и мышей с использованием описанного метода.

Реологические испытания подтвердили, что более 90% гелеобразования происходит в первые минуты после достижения 37 градусов Цельсия. Образовавшиеся гидрогели были стабильны в течение длительных периодов времени в PBS, но прикрепление и пролиферация клеток могут меняться со временем. Прегелевый раствор был протестирован в качестве кодирующего для улучшения прикрепления клеток.

Прикрепление и пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека измеряли с помощью MTTSA. Улучшения наблюдались при покрытии скважин ЭХМ. При изготовлении 3D-гелей добавление генипина увеличивало сшивание гидрогеля.

С помощью частотных разверток на реометре жесткость гидрогеля напрямую коррелировала с концентрацией генипина, при этом медиана и наиболее значимая концентрация составляла 0,01%. После освоения децеллюляризация может быть выполнена за восемь часов в течение четырех дней. Раствор предварительного геля может быть изготовлен за один час в течение двух дней, а образование геля может быть выполнено за два часа в течение двух дней.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как АСМ, вестерн-блоттинг, окрашивание и иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как модуль упругости, белковый состав и клеточный ответ на материал.