Анализируя Благотворное влияние пищевых добавок на Кишечный Эпителиальное барьерные функции Во время экспериментального колита

Общая цель данного протокола заключается в оценке эффектов дополнительных питательных веществ на мышиной модели колита, вызванного декстрансульфатом натрия. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области кишечной иммунологии о развитии клинической науки на протяжении всего направления модельного эксперимента с колитом. Основные преимущества данной методики заключаются в том, что она недорога, не требует сложного оборудования, обеспечивает четкий анализ морфологии всей толстой кишки.

Этот метод может быть использован для оценки окислительного стресса в толстой кишке как следствие чрезмерного набора нейтрофилов. Для введения пищевой добавки через зонд, сначала вручную зафиксируйте мышь за загривок, поместив хвост между третьим пальцем и основанием большого пальца. Далее, удерживая мышь в вертикальном положении, введите иглу для зонда в левую сторону рта животного и осторожно проследите за нёбом, чтобы найти пищевод.

Если сопротивления нет, продвигайте иглу к животу. Медленно вводите весь объем добавки с последующим тщательным извлечением шприца и измерением массы тела животного. Присвойте балл от нуля до четырех в соответствии с процентом потери веса, затем соберите свежий образец стула и с помощью прилагаемых аппликаторов нанесите тонкий мазок образца на предметное стекло из набора для анализа гваякового кала на скрытую кровь.

Закройте крышку на передней части комплекта и откройте заднее окно, чтобы нанести две капли раствора проявителя на заднюю часть места расположения образца. Прочитайте результаты через 30 секунд, присвоив оценку от нуля до четырех в зависимости от мощности сигнала. Затем понаблюдайте за вторым свежим образцом стула, чтобы оценить консистенцию стула, присвоив оценку от нуля до четырех.

Чтобы определить проницаемость эпителия кишечника in vivo, поместите животное под наркозом в положение лежа на спине и сделайте разрез по средней линии, чтобы обнажить кишечник. Найдите слепую кишку и сделайте небольшой разрез в проксимальном сегменте восходящей кишки. Затем вставьте подающую иглу 22 калибра и закрепите иглу обычной лигатурой из шелковой нити.

Осторожно промывайте обильный объем PBS через иглу, чтобы смыть весь кал из толстой кишки, с последующей установкой раствора синего Эванса до тех пор, пока краситель не достигнет анального отверстия. Через 15 минут промойте трубку избыточным объемом PBS до тех пор, пока перианальное вымывание не станет прозрачным. Затем удалите толстую кишку и промойте ткань большим количеством PBS, а затем одним миллилитром шести миллимолярных N-ацетилцистеина, чтобы устранить любой краситель, прилипший к слизи толстой кишки.

Теперь разрежьте толстую кишку в продольном направлении и промойте ткань еще раз PBS и N-ацетилцистеином, затем запишите вес и длину толстой кишки и поместите ткань в два миллилитра N-диметилформамида при комнатной температуре с легким перемешиванием, чтобы извлечь оставшийся краситель, измеряя концентрацию красителя спектрофотометрически на 610 нанометрах на следующее утро. После семи дней лечения сульфатом декстрана натрия или колита, вызванного DSS, рассеките всю толстую кишку и запишите ее длину. Для швейцарских булочек раскройте толстую кишку в продольном направлении, осторожно удалите все фекалии и с помощью тонкой круглой деревянной палочки или щипцов с тонким наконечником скатайте ткань слизистой оболочкой внутрь.

Затем аккуратно поместите ткань внутрь закладной кассеты с последующей фиксацией пятью миллилитрами 10% формальдегида при комнатной температуре. Крайне важно плотно свернуть толстую кишку, не сворачивая, чтобы избежать проблем во время разрезания тканей, которые могут привести к клиническому повреждению тканей и ложной интерпретации как повреждение, связанное с колитом. Через 48 часов промойте образец водопроводной водой в течение 18 часов, после чего следует обезвоживание этаноловым рядом.

После последнего абсолютного погружения этанола обработайте ткань четырьмя одночасовыми инкубациями в ксилоле. После последнего погружения ксилола поместите образец в 50 миллилитров жидкого парафина на одну 17-часовую и одну трехчасовую инкубацию. В конце трехчасовой инкубации погрузите образец в квадратную пластиковую форму объемом 22 кубических миллиметра в 8-10 миллилитров свежего жидкого парафина на 24 часа.

Когда парафин застынет, с помощью микротома получите срезы ткани толщиной пять микрон, затем ненадолго погрузите срезы в литровую водяную баню, содержащую 0,3% желатина, и немедленно поместите образцы на предметные стекла, обработанные полилизином для окрашивания H&E. Для анализа окислительного стресса сначала создайте барьер вокруг ткани с помощью гидрофобной ручки. Затем инкубируйте восемь микронных поперечных сечений ткани в пяти микромолярных DHE, растворенных в воде в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте.

После инкубации следуют три 15-минутные промывки в PBS с бережным перемешиванием при комнатной температуре. Высушите образцы на воздухе и добавьте каплю монтажной среды для защиты флуоресценции. Затем наблюдайте флуоресценцию окисленного этидия на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе с 40-кратным увеличением.

Лечение DSS приводит к постоянному увеличению индекса активности заболевания, как и ожидалось, достигая максимального показателя на седьмой день после индукции. Противовоспалительные диетические добавки задерживают раннее начало колита, в то время как защитные эффекты являются лишь незначительными в более поздние моменты времени. Диетическое вмешательство также может предотвратить вызванное DSS увеличение проницаемости кишечного эпителия, а также сокращение длины толстой кишки.

Окрашивание гематоксилином и эозином залитых парафином дистальных тканей толстой кишки показало, что контрольные образцы демонстрируют нормальную морфологию, в то время как у животных, получавших DSS, наблюдаются типичные признаки колита. Следует отметить, что параллельное лечение диетическими добавками явно облегчает морфологические изменения, вызванные колитом, с общей морфологией, аналогичной контрольной группе. Иммунофлуоресцентное окрашивание дистального отдела толстой кишки также указывает на то, что плотные молекулы соединения инадгеренов интернализуются во время DSS-индуцированного колита и что кокализация этих белков частично теряется при контактах с эпителиальными клетками крипты.

Важно отметить, что эта интернализация уменьшается, когда мыши, получавшие DSS, получают противовоспалительную и антиоксидантную диетическую добавку. Кроме того, устойчивый рекрутирование нейтрофилов в толстую кишку в ответ на DSS-индуцированный колит противодействует диетическим добавкам, что приводит к сопутствующему улучшению окислительного стресса, вызванного нейтрофилами, и незначительному снижению продукции воспалительных цитокинов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как измерения в камере сотечения, для анализа электрического сопротивления эпителиального барьера в толстой кишке.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследования колита и изучения молекулярного механизма патогенеза язвенного колита на воспроизводимой мышиной модели. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать развитие колита и благотворное влияние пищевых добавок на функции кишечного эпителиального барьера. Не забывайте, что работа с живыми животными требует соблюдения высоких этических стандартов, чтобы избежать ненужных страданий.