Анализируя Благотворное влияние пищевых добавок на Кишечный Эпителиальное барьерные функции Во время экспериментального колита

Общая цель данного протокола заключается в оценке влияния дополнительных питательных веществ на мышиной модели колита, индуцированного декстрансульфатом натрия. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии кишечника, касающиеся развития клинической науки в ходе проведения экспериментов с моделью колита. Основными преимуществами данной методики являются низкая стоимость, отсутствие необходимости в сложном оборудовании и возможность проведения четкого анализа морфологии всей толстой кишки.

Этот метод может быть использован для оценки окислительного стресса в толстой кишке, возникающего вследствие избыточного привлечения нейтрофилов. Для введения пищевых добавок с помощью зонда сначала зафиксируйте мышь вручную, захватив ее за загривок и поместив хвост между третьим пальцем и основанием большого пальца. Затем, удерживая мышь в вертикальном положении, введите иглу зонда в левую сторону пасти животного и осторожно проведите ее вдоль неба, чтобы попасть в пищевод.

При отсутствии сопротивления продвиньте иглу в сторону желудка. Медленно введите весь объем добавки, после чего осторожно извлеките шприц и измерьте массу тела животного. Присвойте балл от нуля до четырех в зависимости от процента потери веса, затем соберите свежий образец кала и с помощью прилагаемых аппликаторов нанесите тонкий мазок образца на предметное стекло из набора для гваякового теста на скрытую кровь в кале.

Закройте крышку на передней панели набора и откройте заднее окно, чтобы нанести две капли проявителя на заднюю сторону окна с образцом. Считайте результаты через 30 секунд, присвоив оценку от нуля до четырех в зависимости от интенсивности сигнала. Затем осмотрите второй свежий образец кала для оценки консистенции стула, присвоив соответствующую оценку от нуля до четырех.

Для определения проницаемости кишечного эпителия in vivo поместите анестезированное животное в положение лежа на спине и сделайте разрез по срединной линии, чтобы обнажить кишечник. Найдите слепую кишку и сделайте небольшой разрез в проксимальном сегменте восходящей части ободочной кишки. Затем введите питательную иглу 22-го калибра и зафиксируйте её лигатурой из обычной шелковой нити.

Осторожно промойте иголку большим объемом PBS, чтобы удалить все остатки фекалий из толстой кишки, после чего введите раствор игольчатого синего красителя (Evans blue) до тех пор, пока краситель не достигнет анального отверстия. Через 15 минут промойте трубку избыточным объемом PBS до тех пор, пока промывные воды в перианальной области не станут прозрачными. Затем извлеките толстую кишку и промойте ткань дополнительным объемом PBS, после чего используйте 1 мл 6 мМ N-ацетилцистеина, чтобы удалить краситель, прилипший к слизистой оболочке толстой кишки.

Теперь разрежьте ободочную кишку продольно и еще раз промойте ткань раствором PBS и N-ацетилцистеином, затем зафиксируйте вес и длину ободочной кишки и поместите ткань в два миллилитра N, N-диметилформамида при комнатной температуре при осторожном перемешивании для экстракции оставшегося красителя, измерив концентрацию красителя спектрофотометрически при 610 нанометрах на следующее утро. После семи дней введения декстрансульфата натрия (DSS) для индукции колита вырежьте всю ободочную кишку и зафиксируйте ее длину. Для приготовления «швейцарских рулетов» (swiss rolls) разрежьте ободочную кишку продольно, осторожно удалите содержимое кишечника и с помощью тонкой круглой деревянной палочки или тонкого пинцета сверните ткань так, чтобы слизистая оболочка была обращена внутрь.

Затем осторожно поместите ткань в кассету для заливки, после чего проведите фиксацию с использованием 5 mL 10% формальдегида при комнатной температуре. Важно плотно свернуть ободочную кишку, избегая заломов, чтобы предотвратить проблемы при сечении ткани, которые могут привести к механическому повреждению образца и ложной интерпретации как повреждения, связанного с колитом. Через 48 часов промойте образец проточной водой в течение 18 часов, после чего проведите дегидратацию с использованием серии растворов этанола.

После последнего погружения в абсолютный этанол подвергните ткань четырем часовым инкубациям в ксилоле. После последнего погружения в ксилол поместите образец в 50 миллилитров жидкого парафина для одной 17-часовой и одной трехчасовой инкубации. По окончании трехчасовой инкубации поместите образец в пластиковую форму квадратного сечения 22 кубических миллиметра в 8–10 миллилитров свежего жидкого парафина на 24 часа.

После затвердевания парафина с помощью микротома делают срезы ткани толщиной 5 мкм, затем их кратковременно погружают в водяную баню объемом 1 л с 0,3% желатином и немедленно переносят образцы на предметные стекла, обработанные полилизином, для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Для анализа окислительного стресса сначала создают вокруг ткани барьер с помощью гидрофобного маркера. Затем криосрезы ткани толщиной 8 мкм инкубируют в 5 мкМ растворе DHE в воде в течение 30 минут при 37 °C в темноте.

После инкубации следует три 15-минутных промывки в PBS при осторожном перемешивании при комнатной температуре. Высушите образцы на воздухе и добавьте каплю среды для заключения, чтобы защитить флуоресценцию. Затем исследуйте флуоресценцию окисленного этидия с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа при 40-кратном увеличении.

Лечение DSS приводит к ожидаемому непрерывному повышению индекса активности заболевания, который достигает максимального значения на седьмой день после индукции. Дополнение противовоспалительной диеты задерживает раннее начало колита, в то время как защитные эффекты на более поздних этапах становятся незначительными. Диетическое вмешательство также может предотвратить вызванное DSS повышение проницаемости кишечного эпителия, а также укорочение оболочки толстой кишки.

Окрашивание гематоксилином и эозином тканей дистального отдела толстой кишки, залитых в парафин, показывает, что контрольные образцы имеют нормальную морфологию, тогда как у животных, получавших DSS, наблюдаются типичные признаки колита. Примечательно, что параллельное введение диетической добавки заметно смягчает вызванные колитом морфологические изменения, при этом общая морфология становится схожей с морфологией контрольной группы. Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани дистального отдела толстой кишки также указывает на то, что молекулы плотных и адгезионных соединений интернализируются при индуцированном DSS колите, а колокализация этих белков частично нарушается в контактах эпителиальных клеток крипт.

Важно отметить, что эта интернализация снижается, когда мыши, подвергнутые воздействию DSS, получают противовоспалительную и антиоксидантную диетическую добавку. Кроме того, интенсивное привлечение нейтрофилов в толстую кишку в ответ на индуцированный DSS колит противодействуется диетической добавкой, что приводит к сопутствующему уменьшению окислительного стресса, вызванного нейтрофилами, и незначительному снижению продукции воспалительных цитокинов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как измерения в камере Уринга (oozing chamber), для анализа электрического сопротивления эпителиального барьера в толстой кишке.

После своей разработки эта методика открыла исследователям путь к изучению колита и поиску молекулярных механизмов патогенеза язвенного колита на воспроизводимой мышиной модели. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как анализировать развитие колита и благотворное влияние пищевых добавок на функции кишечного эпителиального барьера. Не забывайте, что работа с живыми животными требует соблюдения высоких этических стандартов, чтобы избежать неоправданных страданий.