Активация аутофагии аэробикой у мышей

активация аутофагии является полезным в профилактике целого ряда заболеваний. Одним из физиологических подходов к индукции аутофагии в естественных условиях является физические упражнения. Здесь мы покажем, как активировать аутофагию с помощью аэробных упражнений и измерения уровней аутофагии у мышей.

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы физиологически активировать аутофагию у мышей путем принудительного или добровольного бега, а затем измерить уровни аутофагии в конкретных тканях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об аутофагии, в частности, о том, как аутофагия и действие способствуют благотворным эффектам, опосредованным аэробными упражнениями. Основное преимущество этой методики заключается в том, что физические упражнения представляют собой быстрое аэробное колебание между аутофагией in vivo с использованием мышей.

Для этого эксперимента начнем с восьми-двенадцатинедельных черных шести мышей C57, несущих трансген для обнаружения аутофагии, вызванной физическими упражнениями, in vivo, известный как GFP-LC3. Для получения подробной информации об использовании беговых дорожек для мышей см. следующую публикацию JoVE. Установите электрический стимул беговой дорожки на низкую интенсивность.

На первых двух занятиях приучите мышей к открытой беговой дорожке под углом десять градусов вверх. В первый день тренируйте мышей в течение пяти минут на беговой дорожке, работающей со скоростью восемь метров в минуту. На второй день запустите мышей в течение десяти минут, сначала со скоростью восемь метров в минуту, а через пять минут увеличьте скорость до десяти метров в минуту.

На третий день запустите мышей в течение полных 90 минут. Запустите беговую дорожку со скоростью десять метров в минуту и поощряйте мышей к бегу, используя легкие толчки, чтобы избежать повторных ударов ногой. Очень важно наблюдать за мышами и манипулировать ими, чтобы они не получали слишком много ударов электрическим током в течение 90-минутной пробежки.

На протяжении всего бега используйте пальцы, чтобы побудить мышей оставаться на беговой дорожке. Через 40 минут 6увеличьте скорость на один метр в минуту. Через 50 минут снова увеличьте скорость на один метр в минуту.

Через 60 минут увеличьте скорость еще на метр в минуту. Через 70 минут начните увеличивать скорость каждые пять минут, чтобы последние пять минут из 90-минутного бега составляли 17 метров в минуту. После окончания испытания при желании немедленно усыпьте мышей для сбора тканей.

Для этого теста размещайте мышей по отдельности. Используйте тот же сорт, что и описанный ранее. Подготовьте беговое колесо для мыши диаметром 11,4 сантиметра с прикрепленным велосипедным одометром.

Каждый оборот должен измерять ход 358 миллиметров. Переместите мышь в клетку, содержащую колесо, и позвольте мыши свободно использовать его в течение двух недель. Каждые 24 часа записывайте расстояние, пройденное мышью, с одометра.

По прошествии двух недель при необходимости соберите ткани для анализа. Чтобы измерить поток аутофагии, обрабатывайте мышей ингибитором аутофагии, хлорохином, в течение трех дней. Растворите хлорохин в PBS в дозе пять миллиграммов на миллилитр и вводите его мышам внутрибрюшинно в дозе 50 микрограммов на грамм.

Делайте мышам по одной инъекции в день в течение трех дней подряд и собирайте ткани через три часа после последней инъекции. Для мышей, тренированных на беговой дорожке, начните 90-минутный бег через 90 минут после инъекции на третий день, чтобы бег закончился через три часа после инъекции. Затем усыпьте мышей и немедленно заберите их ткани.

Подготовьтесь к огрублению животного в течение 90 минут после тренировки, подготовив фиксатор. Загрузите в шприц объемом 30 миллилитров от 15 до 20 миллилитров свежеприготовленного четырехпроцентного параформальдегида и соедините шприц с иглой катетера 20 калибра. Подсоедините заряженный шприцевой насос и установите его на 90 миллилитров в час непрерывного потока.

С животным на чистой рабочей поверхности, в положении лежа на спине, разрежьте грудную полость через диафрагму, чтобы обнажить сердце. Теперь введите иглу катетера в правый желудочек. Далее сделайте небольшой разрез на печени, чтобы слить кровь и запустить насос.

Вводите фиксатор до тех пор, пока легкие и печень полностью не побледнеют. Обычно достаточно 15 миллилитров фиксатора. После обильности извлеките иглу и соберите интересующие ткани.

Чтобы собрать скелетную мускулатуру, рассеките латеральную широкую мышцу. Кратковременно оттяните кожу ноги назад, чтобы обнажить мышцы и локализовать четырехглавую мышцу бедра. Затем рассеките латеральную широкую мышцу, которая является внешней мышцей, прикрепленной к верхней части бедренной кости.

Для дальнейшей фиксации и обезвоживания поместите собранные ткани в четырехпроцентный параформальдегид на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день переведите ткани на 15-процентную сахарозу PBS и дайте им впитаться при температуре четыре градуса Цельсия на ночь или пока они не осядут в растворе. Затем переведите ткани на 30-процентную сахарозу PBS при температуре четыре градуса Цельсия на ночь или дольше.

Во время этих ванн держите салфетки как можно дольше в темноте. Затем поместите салфетки в среду для встраивания, такую как ОКТ, и при необходимости разрежьте их на более мелкие кусочки. Затем дайте им акклиматизироваться в течение нескольких минут в небольшой чашке Петри.

После этого переложите их в криоформы с достаточным количеством ОКТ, чтобы покрыть. В формочках ориентируйте секционные поверхности по направлению к дну и избегайте образования пузырей. Затем заморозьте образцы в закрытом поролоновом холодильнике, наполненном сухим льдом, пока ОКТ не станет белым.

Теперь заверните отдельные образцы в маркированную фольгу, запечатайте их в полиэтиленовый пакет и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию до тех пор, пока они не будут обработаны. Используя GFP помеченный LC3 в качестве репортерной системы, индукция аутофагии наблюдалась у мышей, которых тренировали так, как описано. После стимуляции аутофагии LC3 транслоцировался из цитозоля в аутофагосому в точечных структурах.

У тренированных мышей было гораздо больше точек GFP-LC3 как в скелетных мышцах, так и в коре головного мозга по сравнению с мышами в состоянии покоя. Вестерн-блоттинг с использованием антител к LC3 показал, что физические упражнения в значительной степени индуцировали генерацию липидного конъюгативного LC3-II, что позволяет предположить увеличение конверсии цитозольного LC3-I в LC3-II. Затем была измерена деградация аутофагического рецептора груза, p62.

90 минут занятий на беговой дорожке вызвали более высокую деградацию p62 в скелетных мышцах, чем в состоянии покоя. Этот эффект был спасен инъекцией хлорохина перед тренировкой. Поскольку хлорохин является ингибитором лизосомальной деградации, эти данные указывают на то, что наблюдаемые явления обусловлены повышенным аутофогическим потоком, а не блокировкой деградации аутофагосом.

После своего развития этот метод имел предшественников в области аутофагии для изучения влияния физических упражнений на деградацию метаболизма и поведения животных. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно следить за мышами во время их бега. За этой процедурой следуют такие методы, как электрическая микроскопия.

Микроскопия животных может быть выполнена для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как физические упражнения в отдельных путях аутофагии, таких как митофагия и липофагия.