Активация аутофагии аэробикой у мышей
3 февраля 2017 г.
активация аутофагии является полезным в профилактике целого ряда заболеваний. Одним из физиологических подходов к индукции аутофагии в естественных условиях является физические упражнения. Здесь мы покажем, как активировать аутофагию с помощью аэробных упражнений и измерения уровней аутофагии у мышей.
Общая цель данного эксперимента заключается в физиологической активации аутофагии у мышей посредством принудительного или произвольного бега с последующим измерением уровней аутофагии в конкретных тканях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы об аутофагии, в частности о том, какой вклад вносят аутофагия и физическая активность в благотворный эффект, опосредованный аэробными упражнениями. Основным преимуществом данного метода является то, что физические упражнения представляют собой быстрый способ стимуляции аутофагии in vivo с использованием мышей.
Для данного эксперимента используйте мышей линии C57BL/6 в возрасте от восьми до двенадцати недель, несущих трансген GFP-LC3 для детекции индуцированной физическими нагрузками аутофагии in vivo. Подробную информацию об использовании беговых дорожек для мышей см. в следующей публикации JoVE. Установите низкую интенсивность электрической стимуляции беговой дорожки.
В течение первых двух сеансов проведите акклиматизацию мышей на открытой беговой дорожке с уклоном десять градусов вверх. В первый день подвергайте мышей физической нагрузке в течение пяти минут при скорости беговой дорожки восемь метров в минуту. Во второй день обеспечьте бег мышей в течение десяти минут, первоначально при скорости восемь метров в минуту, а через пять минут увеличьте скорость до десяти метров в минуту.
На третий день подвергните мышей бегу в течение полных 90 минут. Запустите беговую дорожку со скоростью 10 м/мин и стимулируйте мышей к бегу с помощью осторожных подталкиваний, чтобы избежать повторных ударов током. Крайне важно наблюдать за мышами и корректировать их поведение, чтобы они не получали слишком много ударов током во время 90-минутного забега.
На протяжении всего забега используйте пальцы, чтобы стимулировать мышей оставаться на беговой дорожке. Через 40 минут увеличьте скорость на один метр в минуту. Через 50 минут снова увеличьте скорость на один метр в минуту.
Через 60 минут увеличьте скорость еще на один метр в минуту. Через 70 минут начните увеличивать скорость каждые пять минут таким образом, чтобы в последние пять минут 90-минутного забега скорость составляла 17 метров в минуту. По завершении испытания, при необходимости, немедленно проведите эвтаназию мышей для забора тканей.
Для данного теста содержите мышей индивидуально. Используйте ту же линию, что была описана ранее. Подготовьте беговое колесо для мышей диаметром 11.4 сантиметра с прикрепленным велоодометром.
Длина одного оборота должна составлять 358 мм. Поместите мышь в клетку с колесом и позвольте животному свободно пользоваться им в течение двух недель. Каждые 24 часа регистрируйте расстояние, пробежавшее мышь, по показаниям одометра.
По истечении двух недель соберите ткани для последующего анализа по мере необходимости. Для измерения аутофагического потока введите мышам ингибитор аутофагии хлорохин в течение трех дней. Растворите хлорохин в PBS в концентрации 5 mg/mL и введите мышам внутрибрюшинно в дозе 50 µg/g.
Делайте мышам по одной инъекции ежедневно в течение трех дней подряд, затем возьмите образцы тканей через три часа после последней инъекции. Для мышей, подвергающихся нагрузке на беговой дорожке, начните 90-минутный забег через 90 минут после инъекции в третий день, чтобы бег завершился через три часа после инъекции. Затем эвтаназируйте мышей и немедленно возьмите образцы тканей.
Подготовьте фиксатор, чтобы провести перфузию животного в течение 90 минут после физической нагрузки. Наберите в шприц объемом 30 мл от 15 до 20 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида и соедините шприц с иглой катетера 20G. Установите наполненный шприц в дозирующий насос и настройте его на непрерывный поток со скоростью 90 мл/ч.
Поместив животное в положение на спине на чистую рабочую поверхность, вскройте грудную полость через диафрагму, чтобы обнажить сердце. Затем введите иглу катетера в правый желудочек. После этого сделайте небольшой надрез на печени для оттока крови и запустите насос.
Вводите фиксатор до тех пор, пока легкие и печень полностью не побледнеют. Обычно достаточно 15 milliliters фиксатора. После перфузии извлеките иглу и соберите интересующие ткани.
Для забора скелетных мышц препарируйте латеральную широкую мышцу бедра (vastus lateralis). Осторожно оттяните кожу ноги назад, чтобы обнажить мышцы и локализовать четырехглавую мышцу бедра (quadriceps femoris). Затем выделите латеральную широкую мышцу бедра — внешнюю мышцу, прикрепленную к верхней части бедренной кости.
Для дальнейшей фиксации и дегидратации поместите полученные ткани в 4% раствор параформальдегида на 24 часа при температуре 4 °C. На следующий день перенесите ткани в PBS с 15% сахарозой и оставьте их вымачиваться при 4 °C на ночь или до тех пор, пока они не осядут в растворе. Затем перенесите ткани в PBS с 30% сахарозой при 4 °C на ночь или на более длительный срок.
Во время этих процедур максимально ограничьте воздействие света на ткани. Затем поместите ткани в среду для заливки, например OCT, и при необходимости разрежьте их на более мелкие фрагменты. После этого дайте им адаптироваться в течение нескольких минут в небольшой чашке Петри.
После этого перенесите их в криоформы, добавив достаточное количество OCT для полного покрытия. В формах ориентируйте поверхности для среза дном вниз и избегайте образования пузырьков. Затем заморозьте образцы в закрытом пенопластовом контейнере, заполненном сухим льдом, до тех пор, пока OCT не станет белым.
Теперь заверните отдельные образцы в промаркированную фольгу, поместите их в пластиковый пакет и храните при температуре -80 °C до момента обработки. Используя систему репортеров на основе LC3 с GFP-меткой, наблюдали за индукцией аутофагии у мышей, подвергавшихся физическим нагрузкам согласно описанному методу. После стимуляции аутофагии LC3 перемещался из цитозоля в аутофагосомы, образуя пунктирные структуры.
У мышей, подвергавшихся физическим нагрузкам, наблюдалось значительно большее количество пунктирных структур GFP-LC3 как в скелетных мышцах, так и в коре головного мозга по сравнению с мышами в состоянии покоя. Вестерн-блот-анализ с использованием антител к LC3 показал, что физические нагрузки значительно индуцировали образование липид-конъюгированной формы LC3-II, что указывает на усиление конверсии цитозольной формы LC3-I в LC3-II. Затем была измерена степень деградации p62, рецептора аутофагического груза.
90 минут бега на беговой дорожке вызвали более выраженную деградацию p62 в скелетных мышцах по сравнению с состоянием покоя. Этот эффект был нивелирован инъекцией хлорохина перед физической нагрузкой. Поскольку хлорохин является ингибитором лизосомальной деградации, эти данные указывают на то, что наблюдаемое явление обусловлено повышенным аутофагическим потоком, а не блоком деградации автофагосом.
После разработки данной методики появились предшествующие исследования в области аутофагии, направленные на изучение влияния физических упражнений на механизмы метаболической деградации и поведение животных. При выполнении данной процедуры важно контролировать мышей во время бега. После завершения этой процедуры применяются такие методы, как электронная микроскопия.
Микроскопия тканей животных может быть проведена для поиска ответов на дополнительные вопросы, такие как роль физических упражнений в селективных путях аутофагии, например, митофагии и липофагии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается активация аутофагии в результате аэробных физических нагрузок у мышей. Путем измерения уровней аутофагии в определенных тканях работа направлена на выяснение физиологических преимуществ физических упражнений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Физиология
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Автофагия представляет собой клеточный процесс, который способствует деградации и переработке клеточных компонентов.
- Известно, что физические упражнения индуцируют автофагию in vivo.
- Понимание взаимосвязи между физическими нагрузками и автофагией может дать представление о профилактике заболеваний.
- В данном исследовании используются мыши линии C57 black six с трансгеном для детекции индуцированной физическими упражнениями автофагии.
Цель исследования
- Активация аутофагии у мышей посредством принудительного или добровольного бега.
- Измерение уровней аутофагии в конкретных тканях после физической нагрузки.
- Изучение роли аутофагии в обеспечении положительных эффектов аэробных упражнений.
Используемые методы
- Использование мышей линии C57BL/6 в возрасте от восьми до двенадцати недель.
- Применение беговой дорожки для физических упражнений с низкоинтенсивной электрической стимуляцией.
- Измерение уровней аутофагии с использованием трансгена GFP-LC3.
- Сравнение уровней аутофагии до и после физических упражнений.
Основные результаты
- Аэробные физические нагрузки успешно индуцировали активацию аутофагии.
- В различных тканях после нагрузки наблюдались разные уровни аутофагии.
- Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что физические упражнения усиливают аутофагию.
- Результаты способствуют пониманию физиологической пользы физических нагрузок.
Выводы
- Аэробные физические нагрузки являются эффективным методом активации аутофагии in vivo.
- Понимание роли аутофагии может помочь в разработке стратегий профилактики заболеваний.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения механизмов, лежащих в основе этих эффектов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
В данном исследовании представлен физиологический метод активации аутофагии in vivo с помощью аэробных физических нагрузок у мышей, что обеспечивает нефармакологический подход к модуляции ключевого пути клеточной деградации. Возможность количественной оценки аутофагического потока с помощью маркеров LC3 и p62 позволяет снизить механистические риски при проведении вмешательств, связанных с физическими нагрузками, в доклинических моделях. Это способствует валидации мишеней и разработке методов анализа для заболеваний, при которых модуляция аутофагии имеет терапевтическое значение.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать аутофагию как терапевтическую мишень посредством физиологической индукции, а не с помощью фармакологических агентов.
- Практическая ценность: использование репортерной системы GFP-LC3 для визуализации образования автофагосом в конкретных тканях, таких как скелетные мышцы и кора головного мозга.
- Прогностическая ценность: измерение конверсии липидированного LC3-II и деградации p62 для оценки аутофагического потока, что подтверждает взаимодействие с мишенью и достоверность модуляции пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Устанавливаются стандартизированные протоколы физических упражнений на беговой дорожке и добровольного бега в колесе для индуцирования аутофагии в различных органах.
- Количественные показатели: Применяются вестерн-блоттинг и микроскопия для измерения уровней LC3-II и деградации p62 в качестве надежных показателей аутофагической активности.
- Воспроизводимость: Включается обработка хлорохином для разграничения усиленного аутофагического потока и нарушенной деградации, что повышает специфичность анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: связывает аэробные упражнения с усилением аутофагии в печени, сердце, головном мозге и мышцах — тканях, имеющих значение при метаболических, нейродегенеративных и сердечно-сосудистых заболеваниях.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает поддержку доклинической оценки вмешательств в образ жизни, предоставляя количественный биомаркер (LC3-II/p62) для определения активации данного пути.
- Снижение механистических рисков: позволяет уточнить, обусловлены ли наблюдаемые положительные эффекты усилением аутофагического потока или же блокированием деградации, что сокращает количество ложноположительных интерпретаций.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум исследований — от проверки гипотез о мишенях до доклинической валидации, особенно для путей, связанных с клеточным гомеостазом и стрессовым ответом.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о роли аутофагии в полезных эффектах физических упражнений за счет возможности контролируемой индуцибельной активации in vivo.
- Скрининг: Позволяет подготовить валидированные биологические системы (например, ткани мышей после физических нагрузок) для последующего скрининга соединений или генетического скрининга регуляторов аутофагии.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку зависимых переменных (конверсия LC3-II, деградация p62), что позволяет проводить сравнение между различными условиями и временными точками.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты фундаментальных открытий с доклиническими исследованиями путем сопоставления индуцированной упражнениями аутофагии со специфическими моделями заболеваний в тканях.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для оценки модуляции аутофагии при различных заболеваниях с применением стандартизированных протоколов физических нагрузок и методов детекции.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов регуляции аутофагии, снижая неопределенность при проведении исследований по валидации мишеней.
- Операционная ценность: предоставляет стандартизированные, воспроизводимые процедуры для индукции и измерения аутофагии in vivo с использованием общедоступного оборудования (беговых дорожек, беговых колес).
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), обеспечивая доклиническую оценку стратегий модуляции аутофагии с физиологической значимостью.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации программ, направленных на воздействие на аутофагию, с учетом рисков на основе прогностических доклинических данных о механизмах действия.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с животными, знание физиологии упражнений и соблюдение сроков забора тканей во избежание искажающего влияния стресса или травм.
- Зависимость от инструментария, включая калиброванные беговые дорожки, беговые колеса с одометрами и системы перфузии для фиксации тканей.
- Необходима стандартизация между лабораториями продолжительности и интенсивности упражнений, а также дозирования хлорохина для обеспечения сопоставимости измерений аутофагического потока.
- При адаптации метода следует учитывать тканеспецифическую вариабельность ответа аутофагии и необходимость своевременного забора образцов после упражнений или введения ингибитора.
- Практические ограничения включают индивидуальную вариабельность дистанции при произвольном беге и техническую сложность поддержания постоянной интенсивности нагрузки без избыточного применения электрошока.
