Изображение наведением, на основе лазера Изготовление сосудисто-производных микрожидком сетей

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы описать, как использовать конфокальный микроскоп, оснащенный фемтосекундным импульсным лазером, для создания трехмерных сосудистых биомиметических микрофлюидных сетей, встроенных в диакрилатные гидрогели полиэтиленгликоля, с использованием лазерной деградации под визуальным контролем. Существенным преимуществом этого метода является возможность создания трехмерных биомиметических микрофлюидных сетей, которые точно повторяют плотность, извилистость, диапазон размеров и общую архитектуру сосудистой сети in vivo в синтетических конструкциях. Этот подход к микрофлюидному производству расширит наши возможности по созданию большего количества тканевых конструкций in vivo, биомиметических моделей заболеваний и устройств сверхвысокой плотности на чипе.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что правильная настройка и реализация программного обеспечения микроскопа не интуитивно понятны, но имеют решающее значение для формирования желаемых микрофлюидных сетей. Многие подготовительные шаги описаны в текстовом протоколе, включая создание виртуальных масок, настройку микроскопа и загрузку виртуальных масок в программное обеспечение микроскопа. Чтобы фотополимеризировать гидрогель PEGDA, сначала прикрепите кольцо двустороннего клея к чашке Петри диаметром 60 миллиметров, в дне которой вырезано 20-миллиметровое отверстие.

Далее в вытяжной шкаф добавьте один миллилитр HBS с TEOA в двухмиллилитровую янтарную центрифугу, покрытую фольгой. Затем добавьте в тюбик 10 микролитров одной миллимолярной соли Eosin Y disodium salt. Теперь с помощью стеклянной пипетки нанесите небольшой объем NVP в стеклянный стакан.

Из этого объема возьмите 3,5 микролитра НВП и перенесите его в смесь. Затем добавьте 10 миллиграммов PEGDA 3,4 килодальтона во вторую пробирку, покрытую фольгой. Затем добавьте 0,2 миллилитра смеси, чтобы получить раствор преполимера PEGDA весом 5% по объему.

Теперь переведите раствор преполимера в вихрь до полного растворения PEGDA. Затем нанесите пипетку объемом 60 микролитров на форму PDMS без образования пузырьков. Теперь отцентрируйте акрилированное 40-миллиметровое стекло номер 1,5 над раствором на распорках PDMS.

Затем поместите сборку под источник белого света, откалиброванный на мощность 95 милливатт. Полимер отверждается в течение трех минут. Затем пролейте дистиллированную воду между формой и покровным стеклом, чтобы отделить гидрогель от PDMS и смыть гидрогель.

Затем тщательно промокните края покровного стекла, не отводя воду из гидрогеля. Теперь приклейте покровную пленку к подготовленной чашке Петри. Помогает небольшое давление.

Затем погрузите гидрогель в дистиллированную воду. Настройте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, как описано в текстовом протоколе, и начните с конфигурации визуализации гидрогеля. Затем установите гидрогель и чашку Петри на сценическую вставку и поставьте ее на сцену.

Затем наполните чашку Петри не менее чем пятью миллилитрами дистиллированной воды и опустите объектив погружения воды чуть выше гидрогеля, не соприкасаясь с ним. Теперь нажмите кнопку реального времени, чтобы включить линию аргонового лазера. Затем сосредоточьтесь на гидрогеле до тех пор, пока сигнал Eosin Y не станет виден на верхней стороне гидрогеля.

Чтобы помочь найти гидрогель, попробуйте временно увеличить процент мощности или размер отверстия. Отметьте расположение верхней и нижней части гидрогеля, а также дна лунки. Затем с помощью джойстика двигайтесь поперечно и найдите края колодца.

В окне фокусировки опустите плоскость фокусировки вниз на 150 микрон внутри гидрогеля с помощью стрелки вниз рядом с полем положения Z. Следующий шаг имеет решающее значение. Обнулите позиции X и Y в окне рабочей области, затем удалите все остальные отмеченные места и отметьте только обнуленное местоположение.

Теперь, чтобы начать процесс формирования входного канала, сначала сделайте снимок, а затем с помощью прямоугольной кнопки в окне регионов наметьте область, которая будет входом в сосудистую сеть. Затем перейдите к конфигурации формирования канала. Подробности указаны в текстовом протоколе.

Оказавшись там, в окне стека Z нажмите центральные кнопки вверху и вверху смещения, чтобы центрировать стек Z в текущем положении. Затем, в зависимости от того, насколько большим должно быть входное отверстие, установите количество ломтиков с интервалом в один. Теперь убедитесь, что скорость установлена на три и что процент мощности установлен на 100.

Затем продолжите сохранение конфигурации и нажмите кнопку «Начать эксперимент». Чтобы визуализировать гидрогель во время деградации канала, либо увеличьте мастер усиления в окне каналов, если область в поле зрения черная, либо уменьшите мастер усиления, если регион белый. После разложения убедитесь, что входное отверстие сформировалось, вернувшись к конфигурации визуализации гидрогеля и нажав на кнопку «В реальном времени».

Во-первых, в окне регионов загрузите любой ovl-файл из стека виртуальных масок Z и нажмите кнопку со стрелкой, чтобы увидеть ROI в поле зрения. Затем нажмите кнопку «В реальном времени», чтобы отсканировать конфигурацию визуализации гидрогеля, и с помощью джойстика или окна рабочей области расположите гидрогель так, чтобы входное отверстие соединилось с правильным местом в сосудистой сети. Затем опустите плоскость фокусировки в первую позицию макроса микроскопа, которая находится на 50 микрон ниже предыдущего центрированного Z-положения, используя размер шага в окне фокусировки и щелкнув стрелку вниз.

Опять же, теперь очень важно повторно обнулить местоположения X и Y, удалить все остальные отмеченные местоположения и отметить только это местоположение в качестве новой нулевой точки. Обязательно сохраните эту новую конфигурацию. Теперь в настройках формирования канала выберите только временные ряды и окна отбеливания.

Далее откройте макрос и выберите вкладку сохранения. Выберите ранее созданный рецепт и нажмите применить. Убедитесь, что вы не нажимаете «Магазин», иначе рецепт будет перезаписан.

После проверки настроек снова сохраните конфигурацию формирования канала, а затем нажмите кнопку «Обновить» в макросе микроскопа. Нажмите кнопку «Нет», чтобы перезаписать текущий список местоположений, а затем нажмите кнопку «Пуск» в макросе микроскопа, чтобы начать рецепт. После завершения процесса деградации используйте конфигурацию визуализации гидрогеля при более низкой мощности лазера, чтобы обеспечить возможность просмотра меченного FITC декстрана, который имеет более яркий сигнал, чем нативный сигнал Eosin Y гидрогеля.

Перед введением декстрана с флуоресцентной маркировкой слейте немного воды из лунки в гидрогель. Затем пипетку в 10 микролитрах отфильтрованного декстрана, меченного FITC. Описанная процедура была использована для преобразования большого объема микрососудистых изображений в серию виртуальных масок для формирования микрофлюидной сети под визуальным контролем.

Полученная микрофлюидная сеть сравнивалась с сосудистой сетью in vivo, из которой она была получена. Лазерная деградация гидрогеля под визуальным контролем позволила создать 3D-биомиметические микрофлюидные сети, которые повторяют размер, извилистость и сложную архитектуру сосудистой сети in vivo. Напорные головки и шприцевые насосы использовались для инициирования потока жидкости в этих встроенных микрофлюидных сетях.

Было замечено, что флуоресцентно меченные 70 килодальтоны декстрана и 10 микрон полистирольные шарики перемещаются слева направо под действием потока, вызванного напором. В качестве альтернативы, поток с приводом от шприцевого насоса инициируется фотополимеризацией гидрогеля внутри вторичного микрофлюидного устройства. Используя тот же протокол, который описан здесь, затем была реализована лазерная деградация для изготовления двухмерной сосудистой сети в гидрогеле для потока, приводимого в действие шприцевым насосом, и обильного содержания декстрана в 65 килодальтонах.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный фемтосекундным импульсным лазером, для создания биомиметических микрофлюидных сетей с использованием лазерной деградации гидрогеля под контролем изображения. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-три часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что параметры лазера, включая мощность, длину волны и скорость сканирования, необходимо регулировать и оптимизировать в зависимости от деградации гидрогелевого состава.

Спасибо и удачи в ваших экспериментах.