Воображение нейтрофильных фагосомы и цитоплазмы Использование индикатора рН логометрической

Эта рукопись описывает простой метод измерения phagosomal рНа и площадь, а также цитоплазматический рН человека и мыши нейтрофилов с помощью радиометрического индикатора seminaphthorhodafluor (Snarf) -1, или S-1. Это достигается с помощью живых клеток конфокальной флуоресцентной микроскопии и анализа изображений.

Общей целью этого метода конфокальной микроскопии является визуализация рН и площади нейтрофильной фагоцитарной вакуоли и цитоплазмы. Этот метод позволяет осуществлять мониторинг и количественную оценку динамических изменений рН в фагоцитарной вакуоли и цитоплазме, а также объема фагоцитарной вакуоли. Эти измерения изменяются в зависимости от активности оксидазы NADPH и могут быть использованы в качестве суррогатных маркеров ее функции и потоков ионов через мембрану фагоцитарной вакуоль.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что как фагосома, так и цитоплазма могут быть одновременно визуализированы с помощью красителя, который имеет широкий диапазон pH. Чтобы начать эту процедуру, приготовьте аликвоту из карбокси-S-1 сукцинимидилового эфира, разведя 50 мкг его в 100 микролитрах высококачественного ДМСО. Вортексом его хорошо перемешать.

Далее приготовьте один миллилитр одного умножить на 10 до восьмой остроты или HK Candida в 0,1 моляре бикарбоната натрия в 15 миллилитровой пробирке. Добавляйте 100 микролитров Carboxy-S-1 по одной капле в HK Candida, перемешивая на вихре при 2000 об/мин. После этого оберните трубку алюминиевой фольгой и поместите ее на валик при комнатной температуре на один час.

Через час промойте HKC-S-1 три раза центрифугированием при 2, 250 раз г в течение 10 минут каждый раз. Для первых двух стирок повторно суспендируйте гранулу в 15 миллилитрах 0,1 молярного гидрокарбоната натрия. После третьей промывки снова суспендируйте его в одном миллилитре буфера BSS.

Перелейте суспензию HKC-S-1 в тубы по 100 микролитров аликвот и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы опсонизировать HKC-S-1 для нейтрофилов человека, добавьте 100 микролитров человеческой сыворотки IGG к 100 микролитрам размороженного HKC-S-1. Перемешайте его в термошейке при температуре 37 градусов Цельсия и 1, 1000 об/мин в течение 60-90 минут, а затем на ролике при четырех градусах Цельсия в течение двух часов.

После этого промывайте образец три раза в буфере BSS центрифугированием при 17 000 г в течение одной минуты каждый. Затем повторно суспендируйте образец в 100 микролитрах буфера BSS. Для выявления нейтрофилов периферической крови человека возьмите 15 миллилитров крови методом венепункции у здорового донора и переложите ее в 20-миллилитровый шприц, содержащий 90 микролитров раствора гепарина натрия в концентрации 1000 МЕ на миллилитр.

С помощью наконечника для пипетки введите в шприц 1,5 миллилитра 10% раствора декстрана. Аккуратно переверните его три раза, а затем оставьте стоять вертикально на скамейке на 30-60 минут. Через 30-60 минут кровь должна разделиться примерно пополам, с соломенным цветом верхнего охристого слоя шерсти и нижнего слоя, содержащего эритроциты.

Осторожно вытолкните верхний слой через иглу или удалите его наконечником пипетки, затем переложите его в пробирку объемом 15 миллилитров и избегайте извлечения красного слоя. Используя пятимиллилитровую пипетку, добавьте три-четыре миллилитра градиентной среды плотности на дно пробирки, ниже охристого слоя шерсти, чтобы получить два отчетливых слоя. Затем центрифугируйте образец при 900-кратном g в течение 10 минут.

Слейте надосадочную жидкость и оставьте красную гранулу. После этого осторожно сделайте вихрь, чтобы потревожить гранулу. Далее добавьте в гранулу семь миллилитров дистиллированной автоклавной воды и переверните ее на 20 секунд для повторного суспендирования гранулы.

После этого добавьте семь миллилитров 2x физиологического раствора и несколько раз переверните его, чтобы перемешать, лизируя оставшиеся эритроциты, затем центрифугируйте образец при 300 г в течение пяти минут. Слейте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в буфере BSS примерно до четырех умно-10 на шестую часть на миллилитр. При этой процедуре предварительно обработайте восьмилуночный микроскопический планшет 200 микролитрами поли-L-лизина в каждой лунке в течение 40-60 минут при комнатной температуре, затем удалите поли-L-лизин и дважды промойте лунки 200 микролитрами дистиллированной воды.

Далее в каждую лунку добавьте по 200 микролитров приготовленной клеточной суспензии и выдержите ее при комнатной температуре от 30 до 60 минут. После этого приготовьте аликвоту эфира S-1-AM, добавив в пробирку 100 микролитров высококачественного ДМСО и перемешайте вихрь. В небольшую пробирку добавьте 1,7 миллилитра буфера BSS и 20 микролитров S-1-AM и

После этого дважды промойте лунки 200 микролитрами буфера BSS и замените буфер раствором S-1-AM. Следите за тем, чтобы не потревожить монослой клеток, прикрепленный к дну лунки, аккуратно проводя пипетирование жидкости по стенке лунки. Впоследствии инкубируйте образец при комнатной температуре не менее 25 минут.

После этого дважды промойте лунки 200 микролитрами буфера BSS. Чтобы испытать ингибитор, составьте мастер-смесь соответствующего препарата в буфере BSS и дважды промойте ею лунки. Затем обрабатывайте ультразвуком HKC-S-1 в течение примерно трех секунд при пяти микронах и добавьте по 10 микролитров в каждую лунку, затем инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-20 минут, делая клетки готовыми к визуализации для снимков фагоцитоза.

С помощью конфокального микроскопа отрегулируйте длину волны лазера таким образом, чтобы клетки возбуждались на частоте 555 нанометров, а излучение регистрировалось двумя детекторами на частотах от 560 до 600 нанометров и более 610 нанометров. Затем просмотрите ячейки с помощью 63-кратного масляного иммерсионного объектива. Используйте непрерывное сканирование изображения плитки для просмотра центральной плитки.

Используя интенсивность флуоресценции и усиление каналов детектора, отрегулируйте фокус и интенсивность лазера, а также усиление двух каналов для оптимизации изображения. После этого разделите изображение с помощью настроек для просмотра обоих каналов. Перед началом эксперимента убедитесь, что в цитоплазме или вакуолях отсутствует насыщение интенсивностью флуоресценции, которые проявляются в виде красных точек.

Если это так, уменьшите интенсивность лазера так, чтобы красных точек было минимально, но клетки и фагосомы были достаточно яркими и четкими, чтобы их можно было увидеть. В этой процедуре откройте ImageJ и загрузите выбранный для анализа файл изображения на панель инструментов. Чтобы объединить два канала, используйте Изображение, Цвет, затем Сделать составным.

Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать файл для хранения результатов. Далее, нажмите на инструмент «Линия» на панели инструментов и дважды кликните, чтобы увеличить ширину до двух. Проведите линию по ширине фагосомы, затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы измерить pH.

Цитоплазматический pH можно измерить таким же образом, проведя линию поперек цитоплазмы. После завершения измерений щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Сохранить файл». Чтобы измерить площадь фагосомы, используйте четвертый значок на панели инструментов, чтобы нарисовать область от руки.

Затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать «Измерить область». Вот качественный визуальный ключ примерного цвета окрашенных S-1 фагосом, соответствующих pH. Желтый цвет указывает на большую кислотность, в то время как красный указывает на большую щелочность.

На этом изображении показаны связанные с мышью нейтрофилы костного мозга, лишенные канала Hvcn1 через 20 минут после фагоцитоза. Фагосомы выглядят очень красными, щелочными и опухшими. Красная стрелка здесь указывает на внутриклеточную Candida, в то время как эта стрелка указывает на внеклеточную Candida.

На этом изображении показаны нейтрофилы костного мозга мышей дикого типа, которые проглотили Candida. Они гораздо менее щелочные, чем нокаутные нейтрофилы Hvcn1. На этом изображении показаны нейтрофилы периферической крови человека в тот же момент времени после фагоцитоза.

Они кажутся немного более щелочными, чем клетки дикого типа мышей, но фагосомы все еще не такие большие и красные, как нокаутные клетки Hvcn1, и на этом изображении показаны нейтрофилы человека, которые фагоцитировали Candida в присутствии пяти микромоляров дифенилена йодония. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за четыре-пять часов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости быть осторожным при выделении нейтрофилов, чтобы они не активировались.

Чтобы определить, являются ли наблюдаемые влияние на изменения вакуолярного или цитозольного pH или вакуолярного объема следствием изменений дыхательного взрыва, этот дыхательный взрыв может быть измерен другими способами, которые непосредственно измеряют выработку свободных радикалов или потребление кислорода. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать нейтрофилы человека, а затем окрашивать и визуализировать фагосому и цитоплазму. Не забывайте, что работа с образцами человеческой крови может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитной одежды.