Воображение нейтрофильных фагосомы и цитоплазмы Использование индикатора рН логометрической

Общая цель данного метода конфокальной микроскопии заключается в визуализации pH и площади фагоцитарной вакуоли и цитоплазмы нейтрофила. Этот метод позволяет отслеживать и количественно оценивать динамические изменения pH в фагоцитарной вакуоли и в цитоплазме, а также определять объем фагоцитарной вакуоли. Эти показатели меняются в зависимости от активности NADPH-оксидазы и могут быть использованы в качестве суррогатных маркеров ее функции и ионных потоков через мембрану фагоцитарной вакуоли.

Основным преимуществом данного метода является возможность одновременной визуализации как фагосомы, так и цитоплазмы с использованием красителя с широким диапазоном pH. Для начала процедуры приготовьте аликвот карбокси-S-1 сукцинимидилового эфира, растворив 50 µg этого вещества в 100 µl высокочистого DMSO. Тщательно перемешайте смесь на вортексе.

Затем в пробирке объемом 15 мл приготовьте 1 мл суспензии термоинактивированных (HK) Candida в концентрации 10⁸ в 0,1 М растворе гидрокарбоната натрия. По капле добавьте 100 мкл carboxy-S-1 к суспензии HK Candida, перемешивая на вортексе при 2 000 RPM. После этого оберните пробирку алюминиевой фольгой и поместите ее на роллер при комнатной температуре на один час.

Через час промойте HKC-S-1 трижды путем центрифугирования при 2 250 ×g по 10 минут каждый раз. При первых двух промывках ресуспендируйте осадок в 15 мл 0,1 M бикарбоната натрия. После третьей промывки ресуспендируйте его в 1 мл буфера BSS.

Перенесите суспензию HKC-S-1 в пробирки по 100 µL и храните их при -20 °C. Для опсонизации HKC-S-1 для нейтрофилов человека добавьте 100 µL сыворотки IgG человека к 100 µL размороженного HKC-S-1. Перемешивайте на термошейкере при 37 °C и 1000 RPM в течение 60–90 минут, а затем на роллере при 4 °C в течение двух часов.

После этого промойте образец трижды в буфере BSS путем центрифугирования при 17 000 ×g по одной минуте за раз. Затем повторно суспендируйте образец в 100 µL буфера BSS. Для получения нейтрофилов периферической крови человека возьмите 15 mL крови путем венепункции у здорового донора и перенесите ее в шприц объемом 20 mL, содержащий 90 µL раствора гепарина натрия в концентрации 1 000 IU/mL.

С помощью наконечника дозатора введите 1,5 milliliters 10% раствора декстрана в шприц. Осторожно переверните его три раза, затем оставьте в вертикальном положении на столе на 30–60 минут. Через 30–60 минут кровь должна разделиться примерно пополам: верхний слой лейкоцитарного слоя будет соломенного цвета, а нижний слой будет содержать эритроциты.

Осторожно вытолкните верхний слой с помощью иглы или удалите его наконечником пипетки, затем перенесите его в пробирку объемом 15 миллилитров, стараясь не захватить красный слой. С помощью пипетки объемом пять миллилитров добавьте три-четыре миллилитра среды для центрифугирования с градиентом плотности на дно пробирки, ниже слоя лейкоцитов (buffy coat), чтобы получить два отчетливых слоя. Затем центрифугируйте образец при 900 ×g в течение 10 минут.

Слейте супернатант, оставив красный осадок. После этого осторожно перемешайте пробу на вортексе, чтобы разбить осадок. Затем добавьте к осадку семь миллилитров дистиллированной автоклавированной воды и переворачивайте пробирку в течение 20 секунд для ресуспендирования осадка.

После этого добавьте семь миллилитров 2x физиологического раствора и несколько раз переверните пробирку для перемешивания, чтобы лизировать оставшиеся эритроциты, затем центрифугируйте образец при 300 ×g в течение пяти минут. Слейте супернатант и ресуспендируйте осадок в буфере BSS до концентрации примерно 4 × 10⁶ на миллилитр. В ходе данной процедуры предварительно обработайте микроскопический 8-луночный планшет, добавив в каждую лунку по 200 µL поли-L-лизина на 40–60 минут при комнатной температуре, затем удалите поли-L-лизин и дважды промойте лунки 200 µL дистиллированной воды.

Затем добавьте по 200 µL подготовленной суспензии клеток в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре от 30 до 60 минут. После этого приготовьте аликвот S-1-AM ester, добавив 100 µL высокочистого DMSO в пробирку и перемешав на вортексе. В маленькую пробирку добавьте 1,7 мл буфера BSS и 20 µL S-1-AM, затем перемешайте смесь на вортексе.

Затем дважды промойте лунки 200 мкл буфера BSS и замените буфер раствором S-1-AM. Чтобы не повредить монослой клеток, прикрепленный к дну лунки, осторожно вносите жидкость по стенке лунок. После этого инкубируйте образец при комнатной температуре не менее 25 минут.

После этого дважды промойте лунки 200 мкл буфера BSS. Для тестирования ингибитора приготовьте мастер-микс соответствующего препарата в буфере BSS и дважды промойте им лунки. Затем обработайте опсонизированные HKC-S-1 ультразвуком в течение примерно трех секунд при пяти микронах и добавьте по 10 мкл суспензии в каждую лунку, после чего инкубируйте планшет при 37 °C в течение 15–20 минут, чтобы подготовить клетки к получению снимков фагоцитоза.

С помощью конфокального микроскопа настройте длину волны лазера так, чтобы возбуждение клеток происходило при 555 нанометрах, а эмиссия регистрировалась двумя детекторами в диапазонах от 560 до 600 нанометров и свыше 610 нанометров. Затем осмотрите клетки, используя масляный иммерсионный объектив 63X. Для просмотра центрального фрагмента используйте режим сканирования по плиткам (tile scan) в непрерывном режиме.

Используя интенсивность флуоресценции и усиление каналов детектора, отрегулируйте фокусировку и интенсивность лазера, а также усиление двух каналов для оптимизации изображения. После этого разделите изображение с помощью настроек, чтобы видеть оба канала. Перед началом эксперимента убедитесь в отсутствии насыщения интенсивности флуоресценции в цитоплазме или вакуолях, которое проявлялось бы в виде красных точек.

Если это так, снизьте интенсивность лазера так, чтобы количество красных точек было минимальным, но при этом клетки и фагосомы оставались достаточно яркими и четкими для наблюдения. В этой процедуре откройте ImageJ и загрузите в панель инструментов файл изображения, выбранный для анализа. Чтобы объединить два канала, перейдите в меню Image, затем Color и выберите Make Composite.

Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать файл для сохранения результатов. Затем выберите инструмент «Линия» (Line Tool) на панели инструментов и дважды щелкните по нему, чтобы увеличить ширину до двух. Проведите линию поперек фагосомы, затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы измерить pH.

Цитоплазматический pH можно измерить аналогичным образом, проведя линию через цитоплазму. По завершении измерений щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Save File. Для измерения площади фагосомы используйте четвертый значок на панели инструментов, чтобы обвести область вручную.

Затем щелкните правой кнопкой мыши и выберите Measure Area. Ниже представлена качественная визуальная шкала примерного цвета фагосом, окрашенных S-1, в соответствии с pH. Желтый цвет указывает на более высокую кислотность, а красный — на более высокую щелочность.

На этом изображении показаны нейтрофилы костного мозга мыши, в которых отсутствует канал Hvcn1, через 20 минут после фагоцитоза. Фагосомы выглядят ярко-красными, щелочными и набухшими. Красная стрелка здесь указывает на внутриклеточную Candida, в то время как эта стрелка указывает на внеклеточную Candida.

На данном изображении показаны нейтрофилы костного мозга мышей дикого типа, поглотившие Candida. Они обладают значительно меньшей щелочностью, чем нейтрофилы с нокаутом Hvcn1. На этом изображении показаны нейтрофилы периферической крови человека в тот же момент времени после фагоцитоза.

Они выглядят несколько более щелочными, чем клетки мыши дикого типа, однако фагосомы все еще не такие крупные и красные, как в клетках с нокаутом Hvcn1; на данном изображении представлены нейтрофилы человека, фагоцитировавшие Candida в присутствии пяти микромолярных diphenylene iodonium. При наличии соответствующего навыка эта процедура может быть выполнена примерно за четыре-пять часов при соблюдении всех правил. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости осторожного выделения нейтрофилов, чтобы избежать их активации.

Чтобы определить, обусловлены ли наблюдаемые изменения pH вакуолей или цитозоля, а также объема вакуолей изменениями респираторного всплеска, данный процесс можно измерить другими способами, которые позволяют напрямую оценить продукцию свободных радикалов или потребление кислорода. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять нейтрофилы человека, а затем окрашивать и визуализировать фагосому и цитоплазму. Не забывайте, что работа с образцами крови человека может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и защитной одежды.