Анализ Cap-связывающих белков в человеческих клетках, подвергнутых Физиологические кислорода Условия

Общая цель этого эксперимента — захват кэп-связывающих белков в условиях низкого содержания кислорода. В этом методе используется аналог семи метил-гуанозиновых колпачков, связанный с агарозой, для исследования факторов, связывающих кап, и их взаимодействующих партнеров. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области синтеза белка, такие как идентификация новых факторов, регулируемых кислородом, участвующих в зависимой от cap трансляции.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что клетки хранятся на рабочей станции для лечения гипоксии вплоть до момента лизиса. Применение этого метода распространяется и на терапию рака, поскольку раковые клетки внутри опухоли подвергаются воздействию очень низких уровней кислорода, а трансляционный контроль играет ключевую роль в прогрессировании опухоли. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы прочитали недавнюю публикацию коллег из Corona, в которой сообщалось, что оксигенация тканей на самом деле ближе к тому, что мы называем гипоксией, а не к нормаксии, при которой клетки обычно культивируются.

Начать эту процедуру будет культивирование клеток так, как описано в текстовом протоколе. После подсчета клеток с помощью гемоцитометра подают 150 миллиметровые культивируемые чашки, содержащие 15 миллилитров готовой среды, до получения плотности клеток от 2500 до 5000 клеток на квадратный сантиметр. Используйте две 150-миллиметровые чашки для каждого теста на связывание колпачков.

Поместите посеянные в инкубатор чашки с посевом в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и пятипроцентном углекислом газе в атмосфере. После того, как клетки инкубируются не менее чем через 24 часа, поместите их в рабочую станцию для лечения гипоксии на желаемое время. Затем настройте рабочую станцию на соответствующую физионику.

Предварительно подогрейте один X фосфатный буферный раствор или PBS и трипсин на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Аликвота 980 микролитров лизисного буфера в центрифужную пробирку объемом 1,5 микролитра для каждого выполняемого анализа связывания колпачков. 10 микролитров коктейля ингибиторов протеазы 100X и 10 микролитров гидрохлорида 4-бензолсульфонилфторида на 980 микролитров буфера лизиса на льду.

Выбросьте фильтрующий материал из каждой 150-миллиметровой чашки в контейнер для отходов на рабочей станции для пациентов с гипоксией. Затем промойте клетки тремя-четырьмя миллилитрами теплого одного X PBS и выбросьте жидкость. Добавьте один миллилитр теплого 05-процентного трипсина ЭДТА в каждое блюдо и оставьте блюда на две минуты или пока клетки не перестанут прилипать к тарелке.

С помощью пипетки переносят ячейки одной пластины в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Повторите по мере необходимости, чтобы каждая пластина клеток была перенесена в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте микроцентрифужные пробирки при 6000 g в течение 90 секунд, чтобы гранулировать клетки.

После центрифугирования аспирируйте трипсин с помощью пипетки, не повреждая гранулу. Промойте клетки теплым одним X PBS, аккуратно набрав 200 микролитров PBS в трубку прямо над гранулой. Затем отсасывайте PBS, не нарушая гранулу.

Далее пипеткой капаем 500 микролитров из одного миллилитра приготовленного лизисного буферного раствора на первую клеточную гранулу. Полностью суспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз. Объедините повторно суспендированные клетки со второй клеточной гранулой и повторно суспендируйте вторую гранулу с помощью пипетирования вверх и вниз.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все гранулы не будут объединены и повторно суспендированы для каждого образца. Далее соедините лизат с оставшимися 500 микролитрами буфера для лизиса в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 литра. Извлеките образцы из рабочей станции при гипоксии.

Лизируйте клетки с помощью мягкого перемешивания, вращая образцы при температуре четыре градуса Цельсия в течение 1,5-двух часов. После инкубации лизированные клетки центрифугируют при 1200-кратном g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить клеточный мусор. Переложите лизат в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и выбросьте гранулу.

Резервируйте часть надосадочной жидкости для использования в качестве контроля ввода лизата всей клетки для вестерн-блоттинга. Для подготовки к анализу связывания колпачка с помощью ножниц удалите кончик пипетки, чтобы облегчить сбор суспензии из гранул. Для каждого образца переведите 50 микролитров контрольной суспензии из заготовительных шариков агарозного шарика и 50 микролитров суспензии из шариков агарозы C10 m7GTP в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Затем гранулируйте шарики, центрифугируя суспензию в 500 раз больше g в течение 30 секунд. Осторожно удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте шарики в 500 микролитрах TBS. Повторив эти действия, гранулируйте шарики в 500 раз г в течение 30 секунд и удалите надосадочную жидкость.

Затем перенесите надосадочную жидкость, содержащую лизат, в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, содержащую заготовки агарозных шариков. Выдерживать в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия при слабом перемешивании. Через 10 минут очистите заготовку из агарозных шариков, центрифугируя при 500 умноженных на g в течение 30 секунд.

После центрифугирования переведите лизат, который не связывается с шариками, в микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра, содержащую шарики, связанные с агарозой С10 m7GTP. Промойте чистые агарозные бусины, повторно суспензив бусины в 500 микролитрах буфера для лизиса, гранулируя бусины центрифугированием при 500 мг g в течение 30 секунд, и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите это четыре раза, всего пять стирок.

Снова суспензируйте пустые шарики агарозы в одном буфере образца X SDS-PAGE. И варите бусины в течение 90 секунд при температуре 95 градусов по Цельсию. Храните образец при температуре 20 градусов Цельсия для будущего вестерн-блоттинга, чтобы наблюдать, связывается ли интересующий белок неспецифическим образом с шариком.

Инкубируйте лизат с шариками, связанными с агарозой c10 m7GTP, с легким перемешиванием в течение одного часа при температуре 4 градусов Цельсия, чтобы захватить белки, связывающие крышки. После перемешивания гранулы m7GTP с агарозой C10 путем центрифугирования в 500 раз больше g в течение 30 секунд. После удаления надосадочной жидкости промойте шарики m7GTP, связанные с агарозой C10, как и раньше.

Повторно суспендируйте шарики в 600 микролитрах буфера для лизиса и добавьте ГТФ до конечной концентрации в один миллимоляр. Инкубируйте шарики с агарозой C10 m7GTP и один миллимолярный GTP с легким перемешиванием в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Это приведет к диссоциации белков, которые неспецифически взаимодействуют с m7GTP.

Гранулируйте шарики m7GTP с агарозой C10 путем центрифугирования при 500 раз g в течение 30 секунд. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 200 микролитров четырех буферов для образцов X SDS-PAGE. После промывки бусин, как и раньше, снова суспендируйте бусины в одном буфере для образцов X SDS-PAGE и кипятите при температуре 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд.

Здесь представлены репрезентативные вестерн-блоттинги типичной аффинной очистки m7GTP двух основных кэп-связывающих белков в ответ на колебания кислорода в эпителиальных клетках первичных проксимальных канальцев почек человека. Клеточные лизаты подвергались воздействию кислорода на восемь, пять, три процента или один процент в течение 24 часов. Дорожки включают 10 процентов лизата всей клетки в качестве входа, промытый GTP для измерения специфичности m7GTP и белки, связанные с гранулами m7GTP после промывки GTP.

Данные, полученные, по крайней мере, в трех независимых экспериментах, были количественно оценены с помощью изображения J и выражены в единицах относительной плотности относительно 10 процентов входящего лизата всей клетки. Результаты показывают, что клетки человека, культивируемые под физиологическим кислородом, используют два связывающих кап белка для рекрутирования различных мРНК для трансляции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как улавливать белки, связывающие конденсаторы, в условиях низкого содержания кислорода.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что клетки должны находиться на рабочей станции гипоксии до момента лизиса, так как кислород может быстро изменить биохимические свойства этих факторов инициации трансляции. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фракционирование полисом, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие связывающие кэп-связывающие белки с активной трансляцией в условиях низкого содержания кислорода.